枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質體制備及再生條件研究

閆思遠，楊富龍，杜 娟，李 金，任苗苗，李嘉泓，顧沛雯

(寧夏大學 農學院，銀川 750021)

內生真菌是指在其生活史中某一階段或全部階段生活于健康植物內部,且被感染的宿主植物(至少是暫時)不表現出明顯病害癥狀的一類真菌[1]。研究發現藥用植物中含有豐富的內生真菌資源，是發現新化合物和獲得生物活性代謝產物的重要來源[2]。2017年，魏碩等[3]從冬凌草中分離出1株草酸青霉菌PenicilliumoxalicumCurrie et Thom，通過HPLC-MS和MTT法測定，發現該菌可以產生冬凌草甲素，且對人乳腺癌細胞系MCF-7的細胞活性具有一定抑制作用。2017年，徐全智[4]從枸杞中分離出1株細極鏈格孢Alternariatenussima，可以產生幾丁質酶和 β-1,3葡聚糖酶，且對枸杞炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides、番茄葉霉病菌Fulviafulva、辣椒炭疽病菌C.capsici等病原真菌具有良好的拮抗作用。2018年，孫牧笛等[5]從苦豆子中分離得到1株細極鏈格孢A.tenussima，其作為真菌誘導子可促進苦豆子組培苗中LDC基因的表達，從而提高宿主氧化苦參堿的含量。但是藥用植物內生真菌通過發酵生產天然活性產物的時間較長[6]、產率較低[7]、分離純化難度較大[8]，成本較高[9]，目前基本上還停留在實驗室的研究階段，無法實現產業化生產。此外，從藥用植物中篩選出的內生真菌，部分性狀不太穩定，在培養過程中容易喪失重要功能[10]，因此迫切需要對其進行全面的生物學研究和遺傳改造。

建立良好穩定的原生質體制備技術是進行分子遺傳學操作的關鍵步驟之一[11]。原生質體誘變[12]、融合[13]、基因組重排[14]、遺傳轉化[15]、基因組編輯技術[16]等都必須以高濃度、高活力的原生質體為前提，所以優化原生質體的制備和再生條件顯得尤為重要。

原生質體是指完整細胞去掉細胞壁結構后所形成的球狀單細胞，可以攝取外源大分子，細胞器，細菌和病毒，具有全能型[17]。酶解法是制備原生質體最常使用的方法，菌齡、酶復配體系、酶解時間、穩滲劑等因素均會對原生質體的制備產生影響[18]。2013年，弭寶彬等[19]通過優化菌齡、酶解體系、酶解時間、酶解溫度及轉速等條件，獲得了尖孢鐮刀菌辣椒?；虵usariumoxysporumf.sp.capsicum原生質體制備的最佳條件。2015年，Ramamoorthy等[20]通過單因素試驗對擬輪枝鐮刀菌F.verticillioides原生質體制備條件進行優化，獲得最大原生質體產量為4.2×106mL-1。2016年，賀薇等[21]通過優化培養基、菌齡、β-巰基乙醇預處理、酶解體系、酶解時間等條件，獲得尖孢鐮刀菌唐菖蒲專化型F.oxysporumf.sp.gladioli原生質體的最大產量為1.4×107mL-1，再生率為57.4%。

筆者前期從健康枸杞根部分離到1株鐮刀菌屬內生真菌F.nematophilumNQ8GⅡ4，該菌株對枸杞炭疽病菌C.gloeosporioides、葡萄灰霉病菌Botrytiscinerea和玉米大斑病菌Exserohilumturcicum等多種植物病原真菌具有較強的拮抗作用，同時還能產生具有較強抑菌活性的揮發性氣體，是1株值得深入研究的高活性功能菌株。為了進一步開展該菌株在原生質體誘變、融合等方面的遺傳改造研究，本研究通過單因素試驗對影響枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質體制備的關鍵因素(菌齡、酶解時間、酶質量濃度、穩滲劑濃度)進行優化，以期通過響應面法獲得該菌株原生質體制備的最佳方案。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質粒 枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株(CGMCC No.19721)由寧夏大學植物病理實驗室分離、鑒定并保存。載體PDL2(含gfp基因)由西北農林科技大學胡小平教授惠贈。

1.1.2 試劑和儀器 潮霉素B(HygromycinB，HmB)購于德國Roche公司；氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)購于北京索萊寶科技有限公司；Miracloth購于美國Calbiochem公司；崩潰酶(Driselase)，溶壁酶(Lyticase)購于美國Sigma 公司。

參照張世杰[22]的方法，配置馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基(PDB)、酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(YPD)和Bottom Agar培養基。

Simpli Nano超微量分光光度計(GE Healthcare公司，美國)；Sigma 3K 15通用臺式冷凍離心機(Sigma公司，美國)；Mettler-toledo LE204E電子分析天平(Mettler-toledo公司，瑞士)。

1.2 方 法

1.2.1 原生質體制備 參照韓小路[23]的方法，略作調整。將枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株在PDA培養基上培養5 d后，打取10個直徑0.5 cm的菌餅，接種于100 mL的PDB培養基中， 25 ℃、175 r/min的條件下震蕩培養4 d。吸取2.5×107個孢子于100 mL YPD培養基中， 25 ℃、175 r/min震蕩培養12～20 h。使用無菌miracloth過濾，0.6～1.2 mol/L NaCl沖洗菌絲至白色，稱量0.05 g于1 mL 15～35 g/L崩潰 酶+10 g/L溶壁酶的酶解液中，30 ℃、90 r/min酶解0.5～3 h。使用無菌miracloth過濾至50 mL離心管中，4 ℃、2 500 r/min離心20 min。加入10 mL STC緩沖液重新懸浮，2 500 r/min離心20 min(重復1次)，加入1 mL STC溶液重懸浮，備用。每個處理設置3個重復。

1.2.2 原生質體再生 參照彭軼楠等[24]的方法，略作調整。將制備好的枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質體懸浮液稀釋3 000倍，吸取70 μL涂布于Bottom Agar培養基上，25 ℃恒溫培養2 d，觀察再生情況。以無菌水處理原生質體為對照，每個處理設置3個重復。

再生率=(Bottom Agar培養基上長出的菌落數-無菌水處理后Bottom Agar培養基上長出的菌落數)/(原生質體產量/3 000×原生質體涂布體積)×100%，有效原生質體量(mL-1)=原生質體產量×再生率。

1.2.3 單因素試驗 按照“1.2.1”制備原生質體的方法，分別考察菌齡(12、14、16、18和20 h)、酶解時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h)、酶質量濃度(15、20、25、30和35 g/L崩潰酶+10 g/L溶壁酶)、穩滲劑濃度(0.6、0.7、0.8、1.0和1.2 mol/L NaCl)等條件對原生質體產量、再生率、有效原生質體量的影響。

1.2.4 響應面法優化條件 根據單因素試驗的試驗結果，以酶解時間(A)、酶質量濃度(B)和穩滲劑濃度(C)為自變量，以原生質體產量(Y1)、再生率(Y2)、有效原生質體量(Y3)作為響應值，利用Design Expert 12.0設計Box-Behnken試驗，共17個試驗點，其中中心點5個，用來估計試驗誤差[25]。具體試驗設計如表1所示。

1.3 統計分析

使用Design Expert 12.0軟件進行Box-Behnken試驗設計；SPSS 23進行數據分析。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface experiment

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 菌齡對枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質體制備和再生的影響 由圖1可知，隨著菌齡的增大，NQ8GⅡ4菌株原生質體產量和再生率呈現先升高后降低的趨勢。當菌齡為16 h時，原生質體產量達到最大，為6.94×107mL-1，再生率達到最大，為5.81%，有效原生質體量達到最大，為40.31×105mL-1。因此選擇16 h菌齡菌絲作為原生質體制備原料。

圖中不同大寫字母表示原生質體產量各水平間差異達顯著水平(P<0.05)；不同小寫字母表示原生質體再生率各水平間差異達顯著水平(P<0.05)，下同

2.1.2 酶質量濃度對枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質體制備和再生的影響 由圖2可知，隨著混合酶液中崩潰酶質量濃度的增加，NQ8GⅡ4菌株原生質體產量和再生率呈現先升高后降低的趨勢。使用30 g/L崩潰酶+10 g/L溶壁酶的混合酶液時，原生質體產量達到最大，為 6.97×107mL-1，再生率達到最大，為5.77%，有效原生質體量達到最大，為40.22×105mL-1。因此選擇25～35 g/L崩潰酶+10 g/L溶壁酶的混合酶液作為酶解液。

圖2 酶質量濃度與枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質體制備及再生的關系Fig.2 Relationship between enzyme mass concentration with preparation and regeneration of NQ8GⅡ4 strain protoplasts

2.1.3 酶解時間對枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質體制備和再生的影響 由圖3可知，酶解時間為2.5 h時，NQ8GⅡ4菌株原生質體產量達到最大，為6.38×107mL-1；當酶解時間為1.5 h時，原生質體再生率達到最大，為6.89%；綜合考慮，當酶解時間為2.5 h時，有效原生質體量達到最大，為37.90×105mL-1。因此，選擇2～3 h作為較適酶解時間。

2.1.4 穩滲劑濃度對枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質體制備和再生的影響 由圖4可知，當穩滲劑(NaCl)濃度為0.7 mol/L時，NQ8GⅡ4菌株原生質體產量達到最大，為 6.56×107mL-1，再生率達到最大，為5.86%，有效原生質體量達到最大，為38.44×105mL-1。因此，選擇0.6～0.8 mol/L NaCl作為較適穩滲劑。

圖3 酶解時間與枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質體制備及再生的關系Fig.3 Relationship between enzymolysis time with preparation and regeneration of NQ8GⅡ4 strain protoplasts

圖4 穩滲劑濃度與枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質體制備及再生的關系Fig.4 Relationship between osmotic pressure stabilizer concentration with preparation and regeneration of NQ8GⅡ4 strain protoplasts

2.2 響應面法優化條件

2.2.1 響應面試驗結果 以單因素試驗結果為基礎，以酶解時間(A)、酶質量濃度(B)、穩滲劑濃度(C)3個因素為自變量，以原生質體產量(Y1)、再生率(Y2)、有效原生質體量(Y3)為響應值，考察因素及因素之間的相互關系對響應值的影響，試驗結果見表2。

運用軟件Design Expert 12.0分析響應面的回歸參數，數學擬合方程及方差分析，并對表2中的數據進行多元回歸擬合分析，得到枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質體產量、再生率和有效原生質體量的二次多項式回歸方程模型。

Y1=6.640 0+0.153 8A+0.480 0B+ 1.380 0C-0.092 5AB+0.615 0AC+0.462 5BC-3.350 0A2- 2.560 0B2-2.150 0C2

(1)

Y2=5.820 0+0.2100A-0.027 5B- 0.565 0C+1.650 0AB-0.812 5AC-0.182 5BC- 0.010 0A2-0.722 5B2-4.480 0C2

(2)

Y3=38.840 0+0.3463A+0.881 2B+ 0.415 0C+0.740 0AB-0.057 5AC+0.167 5BC-17.730 0A2-17.67 0 0B2-20.520 0C2

(3)

模型(1)：一次項中，C為極顯著項 (P<0.01)，A、B均為不顯著項。各因子對原生質體產量影響大小為C>B>A，說明穩滲劑濃度對原生質體產生的影響最大，其次為酶質量濃度，酶解時間對原生質體產生的影響最小。二次項中，A2、B2、C2為極顯著項，說明酶解時間，酶質量濃度和穩滲劑濃度對原生質體產生的影響是非線性的。交互項中，AB、AC、BC均為不顯著項，說明酶解時間、酶質量濃度、穩滲劑濃度之間的交互影響不明顯。

模型(2)：一次項中，C為顯著項(P<0.05)。各因子對原生質體再生影響大小為穩滲劑濃度>酶解時間>酶質量濃度。二次項中，C2為極顯著項。交互項中，BC相關不顯著；AC相關顯著；AB達到極顯著水平，說明酶解時間與酶質量濃度、酶解時間與穩滲劑濃度對原生質體再生的影響具有交互作用而不是簡單的線性關系。

模型(3)：一次項中，A、B、C均為不顯著項。各因子對有效原生質體量影響大小為酶質量濃 度>穩滲劑濃度>酶解時間。二次項中，A2、B2、C2為極顯著項。交互項中，AB、AC、BC均為不顯著項。

2.2.3 響應面分析試驗因素的相互影響 響應面圖中曲面的陡峭程度表示各因素對響應值的影響程度[26]。等高線的形狀可反映出因素間交互效應的強弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[27]。

由圖5可知，在酶解時間、酶質量濃度、穩滲劑濃度3個因素中，枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質體產量和再生率主要受穩滲劑濃度的影響(圖A1～B3)；有效原生質體量主要受酶質量濃度影響(圖C1～C3)。酶解時間與酶質量濃度、酶解時間與穩滲劑濃度的交互作用對原生質體再生率的影響較為顯著。上述結果與表3結果一致。

表2 響應面試驗設計方案及結果Table 2 Experimental design schemefor response surface methodology and results

表3 回歸方程的顯著性檢驗及方差分析Table 3 Significance test and varianceanalysis of regression equation

圖5 各因素交互作用對枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質體產量(A1～A3)、再生率(B1～B3)、有效原生質體產量(C1～C3)影響的響應面圖Fig.5 Response surface graphs for effect of interaction of various factorson protoplast yield (A1～A3), regeneration rate (B1～B3), available protoplast volume (C1～C3) of NQ8GⅡ4 strain

2.2.4 驗證試驗 根據Design Expert 12.0軟件分析結果，得到枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株最佳原生質體制備條件為，以0.713 mol/L NaCl為穩滲劑，稱量0.05 g菌齡為16 h的菌絲于 1 mL 30.30 g/L崩潰酶+10 g/L溶壁酶的混合酶液中酶解2.5 h。在此條件下進行5次試驗，結果顯示優化后NQ8GⅡ4菌株原生質體平均產量可以達到7.12×107mL-1，與預測值 6.81×107mL-1相差4.56%；再生率平均為 5.56%，與預測值5.67%相差1.98%；有效原生質體量平均為39.59×105mL-1，與預測值 38.53×105mL-1相差2.75%。證明該模型是可靠的。優化后產生的原生質體大小均勻，球體圓潤，菌絲很少(圖6)，可以進行下一步試驗。

A.萌發16 h的枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株菌絲體；B.枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質體；C.枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質體再生

3 討 論

原生質體制備與再生是兩個相互聯系的過程，原生質體的產量和再生率是評價原生質體制備質量的評價指標[26]。獲得一定濃度、純度和活力的原生質體是進行分子遺傳學操作的基礎和前提保障之一[28]。關于絲狀真菌原生質體制備國內外已有不少的研究報道，但是由于細胞壁結構較為復雜，組成成分較為多樣，針對特定的絲狀真菌菌株，必須具體分析，綜合考慮，方能得到適合該菌株的原生質體制備條件[29]。本研究通過單因素試驗，證明菌齡、酶質量濃度、酶解時間、穩滲劑濃度等條件對枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質體制備和再生均有影響。單因素條件下NQ8GⅡ4菌株原生質體制備的最佳條件為：菌齡16 h的菌絲0.05 g于1 mL 30 g/L崩潰酶+10 g/L溶壁酶的混合酶液中反應2.5 h；以0.7 mol/L NaCl作為穩滲劑，原生質體平均產量為6.71×107mL-1，再生率平均為5.85%，有效原生質體量平均為39.29×105mL-1。其中，菌齡主要影響細胞壁的結構、菌體代謝水平和菌體活力。菌齡過短，菌絲細胞壁太薄，產生的原生質體易破碎，導致原生質體產量和再生率都較低；當菌齡過長時，細胞壁增厚，不易酶解，導致原生質體產量及再生率下降[18]。當酶質量濃度較低時，酶解能力較弱，得不到大量的原生質體；酶質量濃度過高時，過量的酶會繼續降解原生質體，導致原生質體產量和再生率降低[30]。酶解時間短，菌絲不能充分酶解產生的大量原生質體；而酶解時間過長，已形成的原生質體被酶解，原生質體上失去再生的細胞殘壁引物，導致原生質體產量和再生率下降[31]。穩滲劑不僅會維持原生質體細胞膜的滲透壓保護原生質體，對酶的活性也有促進作用。穩滲劑濃度過高，不利于原生質體產生，且會使生成的原生質體失水皺縮；而當穩滲劑濃度過低時，則會使原生質體吸水膨脹，體積變大，易于破裂[32]。

本研究以單因素試驗確定的原生質體制備的最適條件為基礎，進行響應面多因素優化試驗，確定酶解時間、酶質量濃度、穩滲劑濃度三因素對原生質體產量、再生率、有效原生質體量的組合效應；得出枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株原生質體最佳制備條件為：以0.713 mol/L NaCl為穩滲劑，稱量0.05 g菌齡為16 h的菌絲于1 mL 30.30 g/L崩潰酶+10 g/L溶壁酶的混合酶液中酶解2.5 h，原生質體產量平均為7.12×107mL-1，再生率平均為5.56%，有效原生質體量平均為39.59×105mL-1，與模型預測值 38.53×105mL-1擬合較好，相對于單因素試驗結果提升 0.76%。這是因為單因素分析中各因素的設定是固定梯度差，只能表現出最佳制備條件的趨勢，最佳制備條件不能反映，并且試驗處理僅為一個方向，各因素之間的相互作用不能體現出來，而響應面分析不僅可以反映出各因素連續變化對于響應值的作用，還可以反映出各因素之間的相互作用以及各因素相互作用下的理論最佳條件[33]。

4 結 論

建立良好穩定的原生質體制備技術是進行分子遺傳學操作的關鍵步驟之一。本研究在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken設計的響應面法進一步優化該菌株原生質體的制備和再生條件，建立以枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株的原生質體產量、再生率和有效原生質體量為響應值，以酶解時間、酶質量濃度和穩滲劑濃度為自變量的三元二次回歸方程。經驗證，模型合理可靠，能夠準確反映NQ8GⅡ4菌株原生質體產量與再生率。NQ8GⅡ4菌株原生質體最佳制備條件為：以 0.713 mol/L NaCl為穩滲劑，菌齡16 h的菌絲 0.05 g于1 mL 30.30 g/L崩潰酶+10 g/L溶壁酶的混合酶液中酶解2.5 h，原生質體產量平均為7.12×107mL-1，再生率平均為5.56%，有效原生質體量平均為39.59×105mL-1。本研究結果為枸杞內生真菌NQ8GⅡ4菌株遺傳改造和后續的分子遺傳學研究奠定基礎。