蜂房在乳癌術后方中應用的可行性研究

宋畢清，李海志

常州市中醫醫院，江蘇常州213000

根據中國藥典記載蜂房具有去腐、生肌、消炎、止痛、促進創口早期愈合的作用[1]。目前已知蜂房含有酚酸類、二苯基庚烷類、萜類、含氮類、黃酮類及酯類等化學物質，其藥理作用有抗腫瘤、抗菌、免疫抑制等[2]。現有文獻[3-4]認為蜂房所含蛋白具有對抗腫瘤作用。如實驗發現蜂房蛋白NVP可能通過激活ERK信號通路從而抑制HepG2細胞增殖。動物在體研究[5]發現蜂房蛋白NVP能誘導白血病細胞凋亡。此外，蜂房對有機溶劑提取物也表現出顯著抗腫瘤作用[6-7]。劉勝等[8]研究發現其含蜂房的乳癌術后方有明顯降低乳腺癌術后復發轉移的作用。研究表明[9]雌激素增加乳腺癌的發病風險，而乳癌術后方中蜂房是否具有雌激素目前尚無文獻報道。該研究通過高效液相色譜法（HPLC法）檢測蜂房和乳癌術后方中雌二醇、炔雌醇、雌酮和己烯雌酚這4種雌激素的有無來判斷其是否適用于乳腺癌患者，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

LC-10AD型高效液相色譜儀、98-1-B電子調溫電熱套、SARTORIUS分析天平、KQ-300VDE型雙頻數控超聲波清洗器、RE52CS-2旋轉蒸發器、循環水式多用真空泵、十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(島津ODS 250 mm×4.6 mm,內徑5μm)、雌二醇（100182-201205）、雌酮（100849-200501）、己烯雌酚（100033-201308）、炔雌醇（100052-200609）對照品（中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用）；甲醇、氯仿、乙腈（色譜純）；娃哈哈純凈水。蜂房及乳癌術后方供試品：生黃芪30 g、黨參12 g、白術9 g、茯苓12 g、南沙參15 g、枸杞子15 g、仙靈脾15 g、巴戟天12 g、肉蓯蓉12 g、莪術30 g、蜂房12 g、石見穿30 g

1.2 樣品處理

1.2.1 雌激素對照品 精密稱取雌二醇、炔雌醇、雌酮和己烯雌酚對照品各5 mg分置50 mL容量瓶中,加甲醇適量,40 kHz超聲處理15 min,放冷至室溫,加甲醇至刻度,搖勻,作為單組分對照溶液。精密稱取對照品各3 mg置于同一50 mL量瓶中,加甲醇適量,40 kHz超聲處理15 min,放冷至室溫,加甲醇至刻度,搖勻制得混合對照溶液。

1.2.2 蜂房供試品 蜂房單味藥材粉碎，取0.5 g粗粉，以定性濾紙包裹，置于索氏提取器中，加入150 mL氯仿，回流提取5 h，提取液倒出，置于蒸發皿中揮干，用甲醇復溶，定容至10 mL，搖勻，取適量過0.45μm微孔濾膜，取續濾液制樣，即得蜂房單味藥材供試品。

1.2.3 乳癌術后方供試品 乳癌術后方稱重，8倍水煎煮2次，過濾，合并濾液，濾液定容，濃縮至(生藥)0.5 g/mL,取濃縮液1 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋，定容，搖勻后取適量過0.45μm微孔濾膜，取續濾液，制樣即得全方供試品。

1.3 HPLC法測定雌激素

色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(島津ODS 250 mm×4.6 mm，內徑5μm);流動相:乙腈-水(50：50);檢測波長:220 nm;柱溫:30℃;進樣量:20μL;理論板數按雌二醇計算,不低于2 000[10]。按上述色譜條件依法檢測雌二醇、炔雌醇、雌酮、己烯雌酚4種雌激素。重復3次。取清晰穩定結果。

2 結果

2.1 對照品

根據混標對照品色譜圖出峰時間分別為8.828、10.913、12.140、14.196 min，見圖1。和雌二醇、炔雌醇、雌酮、己烯雌酚4種雌激素的單品對照品色譜圖（見圖2～5），記錄對應的出峰時間分別為8.824、10.892、12.159、14.112 min。可見均有色譜峰與混標色譜圖上的相對應，見表1。

圖1 混標Figure 1 Mixed Standard

圖2 雌二醇Figure 2 Estradiol

圖3 炔雌醇Figure 3 Ethinyl estradiol

圖4 雌酮Figure 4 Estrone

Figure 5己烯雌酚Figure5 Diethylstilbestrol

表1 對照品的出峰時間(min)Table 1 Peak time of reference substance(min)

2.2 樣品

2.2.1 蜂房單味藥材 索氏提取法提取后制樣，其色譜圖見圖6 。可見色譜圖中沒有與對照品單品及混標4種雌激素對應的峰。

2.2.2 乳癌術后方水提樣品 乳癌術后方水提樣品色譜峰出峰時間分別為4.560、5.525、8.644 min，見圖7。與對照品中4種雌激素無重疊峰。

圖6 蜂房Figure 6 honeycomb

圖7 乳癌術后方Figure 7 Recipe for breast cancer surgery

3 討論

中藥在我國乳腺癌術后的應用普遍。一項5 046名患者參與的上海乳腺癌生存研究顯示97.2%的患者服用過膳食補充劑或中草藥，76.8%的乳癌患者曾使用過中藥，幾乎所有的中藥使用者都將中藥作為癌癥治療的一部分，3/4的人報告[11]說中藥用于增強免疫系統，約2/3的女性認為有效。迄今，無論是觀察性研究還是臨床試驗都未能證實保健品能夠改善癌癥患者的預后，相反還可能增加死亡風險[12]。因此對膳食補充劑及中草藥的使用安全性檢測變得尤為重要。蜂膠、蜂王漿及蜂花粉等膳食補充劑具有雌激素樣作用[13]。有試驗顯示0.8～4μg/mL蜂膠乙醇提取物和乙醚提取物明顯增強雌激素依賴的人乳腺癌細胞MCF-7增值。并通過17β-雌二醇不同濃度的提取物與人雌激素受體結合的試驗、酵母基雄激素及孕酮受體轉錄試驗、未成熟雌性SD大鼠注射提取物試驗闡明機理。結果提示蜂膠通過激活雌激素受體產生雌激素樣作用[14]。而雌激素增加乳癌發病風險，故臨床上禁用于乳癌術后患者，尤其是激素受體陽性乳腺癌患者。

該研究目的在于定性測定蜂房中是否含有雌激素，而非定量檢測，故色譜峰出現即定義為有，而與峰面積無關。單品和混標的藥品劑量不同，所配制液體濃度稍有差異，峰面積有高低并不影響定性結論。通過比較圖2～5與圖1色譜出峰時間得出混標色譜圖中依次出現的色譜峰對應的雌激素為雌二醇、炔雌醇、雌酮、己烯雌酚，也說明混標并不影響各激素的色譜峰保留時間。蜂房單藥水提樣品和含蜂房的乳癌術后方在上述4種激素出現的保留時間內未出現任何峰，說明其不含這4類雌激素，也說明在乳癌術后方煎制過程中多藥相互作用后也沒有這4種雌激素的產生。而在其他時間內出現的峰與這4類雌激素無關，可能與蜂房及乳癌術后方所含的其他物質有關。所含物質有待進一步提取分析。

綜上所述，該次研究未發現蜂房及前述乳癌術后方含有雌二醇、炔雌醇、雌酮和己烯雌酚這4類雌激素。患者可以使用蜂房及該方劑。蜂房及乳癌術后方的化學成分和藥理活性還有待深入研究，今后有必要從化學單體分離、藥理活性及作用機制、細胞實驗、動物實驗等方面展開系統研究，為蜂房及乳癌術后方等臨床應用提供依據。