改善卵母細(xì)胞體外成熟結(jié)局的研究進(jìn)展

包云 柴娟（通訊作者） 盧俏俏 師帥 鄭群 鄒立波（金華市人民醫(yī)院生殖中心 浙江 金華 321000）

輔助生殖技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用為治療不孕癥提供了新的途徑。常規(guī)的體外受精-胚胎移植通過控制性卵巢刺激技術(shù)使相當(dāng)數(shù)量的卵泡同時(shí)發(fā)育，獲得較多的成熟卵母細(xì)胞及胚胎數(shù)量[1]。然而，在患有多囊卵巢綜合征或具有卵巢高反應(yīng)性的不孕女性中應(yīng)用超促排卵易導(dǎo)致卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生，不僅影響卵子的質(zhì)量，降低臨床妊娠率，更有危及患者生命的風(fēng)險(xiǎn)[2-4]。

未成熟卵母細(xì)胞的體外成熟（in vitro maturation， IVM）技術(shù)是從未經(jīng)促排藥物或低劑量藥物刺激的卵巢中，通過穿刺手術(shù)將未成熟的卵母細(xì)胞取出，在體外模擬卵泡內(nèi)環(huán)境促使卵子發(fā)育成熟并具有受精能力的一項(xiàng)技術(shù)。卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志是減數(shù)分裂的啟動(dòng)和完成，這是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，包括細(xì)胞核成熟和細(xì)胞質(zhì)成熟。胞核成熟包括生發(fā)泡破裂，核膜崩解，同源染色體分離，第一極體排出到卵周間隙。胞質(zhì)成熟是指細(xì)胞的蛋白合成模式改變，蛋白合成后的修飾，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器的重新排列。只有核質(zhì)同步成熟的卵母細(xì)胞才具備良好的受精能力和胚胎發(fā)育潛能。

IVM 技術(shù)目前主要應(yīng)用于治療多囊卵巢綜合征患者、促性腺激素刺激高反應(yīng)患者、卵巢低反應(yīng)患者、卵巢早衰和腫瘤患者的生育能力保留等，該技術(shù)自1991 年在一名卵巢早衰的婦女體內(nèi)試驗(yàn)成功后，至今全世界已經(jīng)有上千名健康嬰兒出生[5]。然而，通過IVM 技術(shù)培養(yǎng)的卵母細(xì)胞仍然存在成熟率偏低的問題，各種文獻(xiàn)報(bào)道大約在40%～70%之間，且成功受精的比例也不高，后期的胚胎發(fā)育潛能差，這些都是導(dǎo)致IVM 技術(shù)較常規(guī)體外受精-胚胎移植技術(shù)成功妊娠率偏低的重要原因。目前亟待解決的難題是如何為未成熟卵母細(xì)胞提供與卵泡內(nèi)微環(huán)境相似的培養(yǎng)系統(tǒng)，促使細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的成熟盡可能同步化。本文就目前國(guó)內(nèi)外在改善IVM 結(jié)局上的研究進(jìn)展做一綜述。

1.顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)在IVM 中的作用

在卵泡發(fā)育過程中，顆粒細(xì)胞包裹在卵母細(xì)胞周圍，通過細(xì)胞間的縫隙連接與卵母細(xì)胞進(jìn)行雙向信息傳遞，實(shí)時(shí)調(diào)控卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。根據(jù)顆粒細(xì)胞分布位置的差異，分為壁層顆粒細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞。其中壁層顆粒細(xì)胞廣泛存在于卵泡液中，研究者從體外獲卵后的卵泡液中分離得到壁層顆粒細(xì)胞，然后將收集的未成熟的卵母細(xì)胞與其共培養(yǎng)，選取發(fā)育成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行卵胞漿內(nèi)單精子注射，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，共培養(yǎng)組的卵子成熟率，受精率，卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率更高[6]。卵丘顆粒細(xì)胞緊密包裹著透明帶，惠董娜等[7]在體視顯微鏡下通過機(jī)械分割的方式獲得卵丘顆粒細(xì)胞，并添加在IVM培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)卵子成熟率，受精率和優(yōu)胚率有所提高，后期的的囊胚形成數(shù)也更多。由此可見，顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)可以提高卵母細(xì)胞的體外成熟率，改善胚胎發(fā)育的結(jié)局。卵母細(xì)胞體外成熟的過程會(huì)影響細(xì)胞的基因表達(dá)譜，包括參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，蛋白修飾和細(xì)胞周期的眾多基因。顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)在一定程度上模擬了卵巢內(nèi)的生態(tài)環(huán)境，也可以減少基因突變的發(fā)生[8]。

2.生殖激素在IVM 中的作用

促性腺激素參與了卵泡的整個(gè)發(fā)育過程，卵泡刺激素（Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）在竇前卵泡、竇卵泡和排卵前卵泡的發(fā)育和成熟的啟動(dòng)和調(diào)控發(fā)揮重要作用。Javed A 等[9]在小鼠卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)液中加入FSH，發(fā)現(xiàn)卵泡的直徑相比于對(duì)照組有所增加，且卵泡存活率，卵母細(xì)胞成熟率和生發(fā)泡破裂的發(fā)生率都顯著提高。電鏡觀察表明，未成熟卵母細(xì)胞在添加FSH 的IVM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)36 小時(shí)后，其滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、皮質(zhì)顆粒等細(xì)胞器的數(shù)量增多，細(xì)胞器逐步向皮質(zhì)區(qū)遷移，核仁發(fā)生致密化。72 小時(shí)后，細(xì)胞表面的微絨毛形態(tài)變得細(xì)長(zhǎng)且豎起，皮質(zhì)顆粒呈線性排列，線粒體均勻分布在皮質(zhì)區(qū)中央，這些都是成熟卵母細(xì)胞具備的特征。Arroyo A 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，LH 可以降低排卵前的卵泡環(huán)狀核苷酸水平，從而使卵母細(xì)胞從第一次減數(shù)分裂停滯中釋放出來(lái)。在培養(yǎng)液中加入LH，與LH 受體結(jié)合后通過CNP/NPR2 系統(tǒng)和EGF/EGF 受體網(wǎng)絡(luò)降低環(huán)狀核苷酸水平，從而激活了成熟促進(jìn)因子（maturation promoting factor，MPF），活化的MPF 進(jìn)一步誘導(dǎo)同源染色體分離，完成第一次減數(shù)分裂。

3.抗氧化劑在IVM 中的作用

未成熟卵母細(xì)胞自身代謝及體外培養(yǎng)操作過程中產(chǎn)生過多的活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）導(dǎo)致的氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟阻滯、染色體分離異常、基因表達(dá)異常、細(xì)胞骨架改變及細(xì)胞凋亡等，從而影響未成熟卵核和胞質(zhì)的成熟，降低后續(xù)形成胚胎的發(fā)育潛能。在IVM 培養(yǎng)液中添加抗氧化劑來(lái)平衡過多的ROS，提高細(xì)胞的抗氧化水平是目前體外抗氧化應(yīng)激的主要方式[11,12]。藏紅花素是天然的抗氧化劑，Mokhber[13]等的研究結(jié)果顯示適宜濃度的藏紅花素及藏紅花水提取物可以增加IVM培養(yǎng)基中谷胱甘肽的濃度，改善卵母細(xì)胞細(xì)胞核的成熟率，提高胚胎的發(fā)育潛能。褪黑素是由松果體分泌的可以調(diào)節(jié)情緒、睡眠、生殖及晝夜規(guī)律的內(nèi)源性激素，是一種高效自由基清除劑，具有抗氧化的能力。卵泡液中就存在一定濃度的褪黑素，減輕卵母細(xì)胞在發(fā)育過程中收到的氧化應(yīng)激損傷。有研究表明在IVM培養(yǎng)液中添加低濃度的褪黑素可以提高卵母細(xì)胞的成熟率，受精率，胚胎卵裂率，囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚率[14]。

4.能量物質(zhì)在IVM 中的作用

在卵母細(xì)胞的整個(gè)發(fā)育過程中，葡萄糖和丙酮酸作為能量來(lái)源發(fā)揮重要功能。GV 期的卵母細(xì)胞主要通過消耗葡萄糖維持自身的代謝需求，生發(fā)泡破裂后，對(duì)丙酮酸的利用率開始上升。在培養(yǎng)液中加入一定濃度的葡萄糖和丙酮酸，培養(yǎng)48 小時(shí)，通過時(shí)差成像動(dòng)態(tài)觀察系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)第一極體排出的時(shí)間，發(fā)現(xiàn)添加組的第一極體排出時(shí)間更短，獲得的成熟卵母細(xì)胞的數(shù)量更多。

5.展望

卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)的應(yīng)用雖然在不斷的研究中取得了很大的進(jìn)展，但受體外培養(yǎng)體系，IVM 胚胎發(fā)育潛能低及所獲胚胎的安全性的影響，目前在臨床上的應(yīng)用相對(duì)局限。但隨著生殖醫(yī)學(xué)的發(fā)展，研究者們的不懈努力，卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)會(huì)越來(lái)越完善，造福更多的患者。