窄分布三元醇聚酯的酶催化合成和鏈增長機理研究

石阿鵬, 饒子昆, 郝建原

(電子科技大學 材料與能源學院，四川 成都 610054)

納米材料經常被用來改善諸如藥物、蛋白、基因等醫療制劑的物理化學和生物性能，以達到增強藥物的水溶性，增加藥物的體內循環時間和改善藥物的靶向能力等目的[1-3]。目前的納米材料領域，擁有完美三維對稱結構的dendrimer或者規整度高、分布窄的樹枝狀聚合

物越來越受到廣泛地關注[4-5]，支化結構能夠天然地提供隨支鏈數量成倍增長的功能性末端基團。通常地，通過迭代耦合法(不論是發散迭代耦合還是收斂迭代耦合)，可以合成出化學結構嚴格可控的產品[6-7]。然而，為達到較高的分子量和規整的拓撲結構，耗時而復雜的保護-脫保護過程必不可少[8-9]。因此，對于大規模的產業化生產來說，目前的方法太過復雜且成本較高。最近，一種表面為羥基的2,2-雙羥基丙酸(bis-MPA)規則樹枝狀聚合物被報道出能夠通過一種簡單高效的方法合成出來，并且其提純過程也簡潔可行。但是，聚合期間所用的氟化銫催化劑所帶來的催化劑殘留將嚴重影響產物的生物相容性和生物安全性[10]。

因此，探索一種無毒可規模化生產的方式合成結構規整的窄分布樹枝狀聚酯依舊是一個難題。將多元醇引入到非多糖結構中是一種得到高官能度“智能”材料的有效方法。傳統的化學方法已經成功地用于得到結構明確的多元醇聚酯，然而不論是“一鍋法”中的嚴重交聯現象[11]，還是多步反應中繁瑣的保護與-脫保護程序[12-15]，無不說明了化學催化區域選擇性弱的問題。相對而言，脂肪酶由于其出色的空間、結構選擇性以及溫和的反應溫度，已經逐漸成為一種被廣泛研究的綠色催化劑，可以合成多種功能性聚酯[16]。而且，酶催化對于支化度有著出色的控制力，從而避免了在聚合過程中發生交聯[17]。因此，酶催化聚合在制備支化度可控的樹枝狀聚合物方面前景廣闊。由于脂肪酶主要作用于酯鍵，許多化學敏感的基團(如巰基、二硫鍵、疊氮鍵等)在酶催化聚合過程中能夠完好無損地保留下來[18-20]。目前，丙三醇和其他糖類(如山梨糖醇、甘露醇、乳糖)同二酸/二酯共聚，尤其是同二乙烯基二酯在極性溶劑中的共聚，可以得到較高分子量的多元醇聚酯。在多糖中，山梨糖醇由于在聚合活性上的絕的優勢而得到了更為廣泛的研究。但是由于主鏈羥基較多，到目前為止，得到結構明確的山梨糖醇聚酯仍然是一個挑戰。丙三醇酯酶催化共聚的研究和應用更為廣泛，只是得到的產物往往是無規樹枝狀結構，PDI較大(>3.0)[21-25]。如此差的結構可控性已經大大影響其在先進軟物質納米材料領域的應用。

Kobayashi等[26-27]報道了丙三醇的酶催化聚合，文中根據不同13C NMR特征峰，將丙三醇結構單元分成了四類： 1-取代，1，2-二取代，1，3-二取代和3取代單元。隨后，Gross等[11]報道了一取代，二取代和三取代結構單元分別為端基單元、線型單元和樹枝狀單元。以最常見的脂肪酶N435為催化劑，生物相容的三羥甲基乙烷(TME)和辛二酸二乙酯為反應單體，合成一種結構規整的樹枝狀窄分布多元醇聚酯。并且，將常見的丙三醇聚酯與TME聚酯的酶催化聚合過程作對比，研究其鏈增長行為的不同之處，從而探索規則的樹枝狀結構的形成機理。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Varian-400-MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑, TMS為內標)；Waters Associates Model ALC/GPC 244 型高效液相色譜儀。

三羥甲基乙烷(TME， Sigma-Aldrich, 98%)，丙三醇(成都科龍，98%)，辛二酸二乙酯(Tokyo Chemical Industry， 98%)，脂肪酶N435(Sigma-Aldrich)；其他所用試劑均為分析純。

1.2 合成

稱取三羥甲基乙烷1.201 g(10 mmol)或者丙三醇0.921 g(10 mmol)，真空干燥后加入辛二酸二乙酯2.303 g(10 mmol)，然后再加入相當于反應單體總質量兩倍的二苯醚作為溶劑。隨后，加入干燥好的N435(單體總質量的10%)，在氮氣保護下，油浴反應溫度逐步升高到80 ℃，在常壓下反應2 h。隨后，在真空條件下(10 mmHg)繼續反應46 h。

2 結果與討論

2.1 Poly(suberic acid-TME)(PST)的表征

圖1為PST的1H NMR譜圖。根據三羥甲基乙烷的取代度的不同，將聚合物結構分成了terminal(T)單元，linear(L)單元和dendritic(Den)單元。c1， c2和c3分別代表T單元，L單元和Den單元上的甲基(CH3-)峰，而它們的相對面積則可以被用來計算各個單元結構的比重。

除此之外，GPC分析已經證實了PST的多分散性指數在最終產物中相對較低。由于PST有如此低的多分散性指數(1.40)，預計PST也是一種結構規整的樹枝狀聚合物。

圖1 PST結構和的1H NMR譜圖

表1 PST各個階段1H NMR和GPC

Log M

2.2 PST的鏈增長

結構單元比重、分子量及其分布隨著反應時間的變化趨勢如圖2和表1所示。直觀的，PST的數均分子量在前24 h的時間內幾乎呈現出快速增長。

圖3 PST的鏈增長機理示意圖

為了驗證這一假設，需要對各個階段的鏈增長行為建模。目前超支化分子的結構形狀仍然有許多懸而未決的問題[28]。但是，在酶催化聚合反應中不會發生交聯反應的前提下[17]，提出了3個鏈增長模型：線型增長(linear growth)、支化增長(grafted growth)和樹枝狀增長(dendritic growth)。

根據計算，在最終產物里，TME末端占整個末端比重的94%。純粹的樹枝狀增長最終形成了結構規整的樹枝狀大分子，如圖3所示。這個樹枝狀分子結構中各個結構單元的比重(Den/L/T)接近于1/2/1，與根據1H NMR的計算結果完全吻合(表1, 48 h)；被圈出的結構可以是整個聚合物分子鏈節的基本單元。

2.3 Poly (Suberic acid-glycerol)(PSG)的表征

在相同的反應條件下監測丙三醇聚酯(PSG)的分子結構，分子量等隨著時間的變化，以對比丙三醇聚酯與TME聚酯鏈增長行為的不同之處。類似的，丙三醇聚酯的結構被分成Dendritic(Den)、 Linear(L)和Terminal(T)單元。考慮到丙三醇有不同的酯化反應點位，如伯羥基和仲羥基。根據酯化位點的不同我們把L單元又分成L12單元和L13單元，而T單元被分成T1單元和T2單元(圖4)。

圖4 PSG的單元結構和1H NMR譜圖

2.4 丙三醇酯(PSG)的鏈增長

丙三醇聚酯結構單元比重、分子量及其分布隨時間的變化趨勢如圖5和表2所示。反應前6 h， Den單元一直保持6%～8%的低含量，而線型單元L卻隨著末端單元T的消耗迅速增加；說明在此階段線型增長為主要鏈增長行為。相應的，在反應的前6 h，聚合物的數均分子量也增長緩慢。在6～8 h階段，Den和L單元同時增加，只有T單元在被消耗，這與支化增長(grafted growth)相吻合。隨后，在8～48 h期間，末端T單元的比重始終在緩慢下降，而線型L單元(L12+L13)的比重卻在上下波動，這說明支化增長和樹枝狀增長同時存在。兩種不同的鏈增長行為同時存在最終導致了GPC圖譜上兩個信號峰的出現(圖5)。

Log M

總的來說，丙三醇辛二酯的聚合可以分為3個階段：線型增長階段、支化增長階段和支化+樹枝狀增長階段。從以上的分析來看，樹枝狀鏈增長行為(dendritic growth)只有在高反應活性的線型單元的比重遠遠高于末端基團T時才能成為主要的鏈增長行為。由于支化鏈增長的空間位阻較小，其對反應位點的選擇性較弱，所形成的分子結構也就趨向于無規支化結構。而無序的鏈增長行為也必然導致聚合物的多分散性指數偏大。所以，PSG不能形成窄分布、規整的樹枝狀結構。PSG最終的鏈增長示意圖如圖6所示。

表2 PSG不同反應階段的 1H NMR 和GPC數據綜合

圖6 PSG的鏈增長行為示意圖

通過簡單的酶催化聚合，成功合成了結構規整的、分子量高且分布窄的多元醇聚酯，突破了傳統化學合成難以獲得的高分子量和窄分布。通過對比丙三醇和三羥甲基乙烷的鏈增長行為，結果顯示：要想規避無規樹枝狀結構，必須避免伯羥基和仲羥基的同時存在，因為酶催化反應更傾向于選擇性催化伯羥基，仲羥基在其中的反應活性較弱。