頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法檢測茶葉中雪松醇

蔡普默，朱雪芬，查雯雯，馬春華

（武夷學院茶與食品學院，福建武夷山354300）

茶是一類健康的非酒精飲料，因其芳香風味和具有多種保健功效而廣受歡迎[1]，僅2017年全球茶葉消費總量達544萬噸[2]。茶在我國已有數千年歷史，以其加工工藝來區分，可分為白茶、黑茶、綠茶、紅茶、烏龍茶和黃茶，而不同的茶有著各自獨特的韻味和香氣特征[3]。現階段，已從各類茶葉中分離出700余種揮發性成分，主要含括酯類、醛類、醇類、酮類、雜環類等[4]。其中，雪松醇又名柏木醇、柏木腦，分子式為C15H26O，屬于倍半萜醇[5]，具有溫和的杉木芳香和持久的柏木香，是茶葉木香香型的重要“呈香”物質之一[6]。

香氣是茶葉的靈魂，是茶葉品質優劣的一個重要感官評價因素，決定茶葉等級的評判和價格的制定，影響消費者對茶葉的喜好程度[7]。茶葉香氣的提取完整度，很大程度上決定了茶葉揮發性成分的后續檢測與分析，其有效提取有助于確認茶葉呈香物質、研究香氣性能及揭示茶葉香氣形成機制等[8]。目前，茶葉香氣的常規檢測方法是氣相色譜和質譜聯用技術（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[9]，樣品前處理的方法有多種，如有機溶劑萃取法、同時蒸餾萃取（simultaneous distillation and solvent extraction，SDE）[10]、水蒸氣蒸餾（steam distillation，SD）[11]、超臨界 CO2流體萃 取 （supercritical CO2fluid extraction，SFE-CO2）[12]、液-液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）[13]、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）[14]、固相萃取（solid phase extraction，SPE）[15]、減壓蒸餾萃取法（vacuum distillation extraction，VDE）[10]、頂空吸附法（headspace analysis，HSA）[16]及溶劑輔助風味蒸發法（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）[17]等。

SPME法是一種無溶劑、環境友好型，集合萃取、濃縮和解吸于一體的樣品分析前處理技術，其在相對溫和條件下進行萃取，避免破壞化合物，與其他萃取方法相比，因具操作簡單、設備要求低、靈敏度高、無溶劑干擾的優點而備受關注[14]，該方法目前在萃取茶湯香氣和茶葉干茶香的應用上較廣[18]。由此可見，SPME和GC-MS技術的聯用，將有助于提高分離、定性及定量分析茶葉香氣成分的水平。李云飛等[4]曾通過優化SPME萃取條件，并與GC-MS聯用，建立一套茶葉香氣物質——香葉醇的分析測定方法。

本研究以茶葉為研究對象，對萃取纖維類型、萃取溫度、萃取時間及攪拌速度等萃取參數進行優化，建立雪松醇的GC-MS分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

武夷紅茶大紅袍樣品：市售；雪松醇（分析純）、癸酸乙酯（分析純）：美國Sigama Aldrich公司；乙醇：國藥集團化學試劑有限公司。

7890A-5975C型氣質聯用儀：美國Agilent公司；RCT磁力攪拌器：德國IKA公司；ME55/02分析天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；50/30 μm DVB/微分子篩（Carboxen）/PDMS（DVB/CAR/PDMS）、100 μm PDMS、PA、PDMS/DVB、固相微萃取手柄：美國 Supelco公司；HP-5MS毛細管色譜柱（30 m×250 μm×0.25μm）：美國Agilent Scientific公司。萃取纖維使用前需根據說明書對萃取纖維進行老化。

雪松醇標準溶液的配制：準確稱取一定量的雪松醇標準品用無水乙醇溶解，配制為濃度1.0 mg/mL的儲備液，再用水稀釋成一系列濃度的工作液，儲存于4℃冰箱備用。

基底樣品的制備：將10 g的巖茶葉樣品置于燒杯中，加入75%乙醇溶液浸泡30 min后，洗凈乙醇，用沸水浸泡30 min，多次重復，直至樣品檢測不到雪松醇，烘干、粉碎，過40目篩備用。

1.2 方法

1.2.1 固相微萃取

將50 mm的磁子放入裝有5 mL標準品或樣品萃取液的頂空瓶中，蓋上帶有聚四氟乙烯隔墊的蓋子，將頂空瓶放在磁力攪拌器上水浴加熱；將萃取頭插入樣品瓶中，采用頂空萃取的方式，吸附一段時間，萃取結束后進樣，于250℃解析5 min。

1.2.2 GC-MS條件

GC條件：HP-5MS毛細管色譜柱（30 m×250 μm×0.25μm）；不分流進樣模式，進樣口溫度250℃，載氣為高純氦氣（純度＞99.999%），流速1.0 mL/min；柱流量控制模式：恒壓，49.62 kPa；色譜柱升溫程序：柱溫初始60℃，保持3 min，以3℃/min速率升溫至120℃，保持1 min，再以4℃/min升溫至200℃，保持1 min，最后以5℃/min升溫至240℃，保持1 min。

MS條件：離子源為電子轟擊離子源（electron ionization，EI），電離電壓為70 eV，選擇全離子掃描模式，離子源溫度230℃，四極桿溫度為150℃，接口溫度250℃，輔助加熱器溫度為250℃；溶劑延遲3.0 min。

1.2.3 頂空固相微萃取條件的優化

茶葉中的香氣成分雪松醇，受熱后易揮發，能通過頂空固相微萃取技術高效提取[19]。然而固相微萃取是一個動態平衡的過程，在應用過程中受諸多因素影響，主要有萃取纖維、待測物濃度、萃取時間、萃取溫度及攪拌速度等，因此優化最適宜的萃取條件顯得十分必要[20]。

萃取纖維：選取 50/30 μm DVB/CAR/PDMS、100 μm PDMS、PA和PDMS/DVB 4種萃取纖維；萃取時間：選取 10、20、30、40、50 min；萃取溫度：設置 65、70、75、80、85℃的溫度梯度；攪拌速度：設定200、300、400、500、600 r/min的攪拌速度。優化時固定其他條件，以某一個萃取條件為變量，通過測定不同條件下的目標物峰面積，比較不同萃取條件對萃取雪松醇效率的影響。

1.2.4 方法評估

吸取20 μL不同濃度的雪松醇標準溶液加到裝有0.05 g空白基質的頂空瓶中，同時加入內標溶液20 μL，在優化條件下進行萃取，后經GC-MS分析測定，以信噪比S/N=3時雪松醇的濃度作為儀器檢出限（limit of detection，LOD）。

1.3 數據處理

所有樣品測定的數據為3次重復測定數據的平均值。

2 結果與分析

2.1 頂空固相微萃取條件的優化

2.1.1 萃取纖維的選擇

頂空固相微萃取是待測物在萃取纖維與待測樣品之間的富集平衡過程，萃取纖維在一定程度上影響目標化合物的吸附量及平衡時間，通常與待測物的吸附率呈正相關，而與平衡時間呈負相關。依據“相似相容”原理，可以根據待測物的揮發性和極性，選取與待測物極性相似的萃取纖維材料，以提高方法精確度[21]，纖維對雪松醇萃取的影響見圖1。

圖1 纖維對雪松醇萃取的影響Fig.1 Effects of different fibers on the cedrol extraction

由圖1可知，50/30 μm DVB/CAR/PDMS涂層的萃取纖維對雪松醇的萃取效率最高，后續的條件優化試驗中選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維。

2.1.2 萃取時間的優化

萃取時間是HS-SPME系統中的一個重要參數，受多種因素影響，該系統是待測物、樣品頂空和萃取纖維之間的三相平衡，整個過程只要還未達平衡，待測液的初始濃度及萃取時間都會影響萃取纖維上待測物的含量[22]，萃取時間對雪松醇萃取量的影響見圖2。

圖2 萃取時間對雪松醇萃取量的影響Fig.2 Effects of extraction time on the cedrol extraction

如圖2所示，雪松醇萃取效率隨著時間的增加都呈現逐漸上升的趨勢，在30 min時達到高峰，隨著萃取時間的加長，萃取效率呈現下降的趨勢或者基本保持恒定，因此本試驗選取30 min。

2.1.3 萃取溫度的優化

溶液溫度的升高可以加速分子運動、提高分子運動的動能，加速待測物在各相之間的擴散，進而有利于萃取。但溫度過高易使物質產生高溫反應和解吸，因此在萃取過程中應確定適宜的萃取溫度，以達到最佳萃取效果[20]。萃取溫度對雪松醇萃取量的影響見圖3。

圖3 萃取溫度對雪松醇萃取量的影響Fig.3 Effects of extraction temperatures on the cedrol extraction

從圖3可以明顯看出80℃時的萃取效率最高，因此選定80℃為后續試驗的萃取溫度。

2.1.4 攪拌速度的優化

待測物的擴散速度會隨著攪拌速度的提高而加快，這有利于待測物與萃取纖維之間進行傳質，最終使體系達到萃取平衡的時間縮短，攪拌速度對雪松醇萃取的影響見圖4。

由圖4可知，隨著攪拌速度的增加，萃取效率先增大，在300 r/min時達到最大，之后隨著攪拌速度的增加呈現下降的趨勢。因此，本試驗選擇300 r/min。

2.2 方法評估

雪松醇檢測的線性范圍、相關系數及檢測限見表1，基底加標和樣品的色譜圖見圖5、圖6。

圖4 攪拌速度對雪松醇萃取的影響Fig.4 Effects of stirring speeds on the cedrol extraction

表1 雪松醇檢測的線性范圍、相關系數及檢測限Table 1 Linear range，correlation coefficient and detection limit of cedrol detection

圖5 茶葉基底加標雪松醇色譜圖Fig.5 Chromatogram of cedrol in tea substrate

圖6 茶葉樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of tea sample

如圖5和圖6所示，雪松醇的保留時間在16.1min，用頂空-固相微萃取-氣相色譜-質譜的方法測雪松醇的含量，方法的線性范圍在 1 μg/kg～200 μg/kg，檢測限為0.1 μg/kg，相關標準偏差為4.5%。

2.3 樣品分析

在最優萃取條件下，用該方法檢測幾種巖茶樣品，標號為1～6，測定雪松醇的含量，結果見表2。

表2 茶葉樣品中雪松醇含量分析Table 2 The content analysis of cedrol in tea samples

表2結果表明，這6種茶葉的雪松醇含量在7.26 μg/kg～28.34μg/kg之間，回收率在81.7%～107.6%，相對標準偏差在3.9%～6.2%之間。

3 結論

優化試驗參數是提高檢測靈敏度的重要手段，SPME-GC-MS是一種有效檢測茶葉香氣成分雪松醇的方法，通過探究SPME纖維、萃取溫度、攪拌速度及萃取時間等因素，得到茶葉中雪松醇的固相微萃取條件的最優方案為：50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取涂層的萃取纖維，在萃取溫度為80℃、轉速為300 r/min下萃取30 min。在此優化的萃取條件下，茶葉中雪松醇平均回收率在81.7%～107.6%之間，相對標準偏差是3.9%～6.2%，在 1 μg/kg～200 μg/kg范圍內呈現良好的線性關系。本研究所建立的茶葉中雪松醇的HSSPME-GC-MS分析方法，具有快速、不需要溶劑、靈敏度高等特點，能滿足茶葉中香氣成分雪松醇的檢測。