葛根素對骨質疏松大鼠成骨細胞增殖和活性的影響及其作用機制

方志輝 張天鋒

(湖北省十堰市國藥東風總醫院創傷外科，十堰市 442000，電子郵箱：payuv97@163.com)

骨質疏松是一種全身代謝性疾病，近年來我國骨質疏松患者人數逐年增加[1]。骨質疏松的主要特征是骨量減少，骨組織的顯微結構出現退行性變化，骨脆性增加[1]。有研究表明，成骨細胞與破骨細胞在骨質疏松的發展中發揮重要作用，在各種類型骨質疏松中都會發生不同程度的成骨細胞凋亡，而成骨細胞可促進骨保護素(osteoprotegerin，OPG)與核因子κB受體活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)分泌，起到間接調控破骨細胞信號轉導的作用[2]。臨床上治療骨質疏松的藥物主要是抑制骨吸收，但是對骨形成作用效果不明顯[3]。葛根素通過影響相關蛋白的表達，從而對骨細胞分化起到一定的促進作用[4]。從強直性脊柱炎患者和股骨頸骨折患者髖關節囊組織中分離培養成纖維細胞的研究中，葛根素能抑制正常成纖維細胞和強直性脊柱炎患者成纖維細胞的增殖和成骨性分化[5]。王曉暉等[6]研究發現，葛根素可以有效改善糖尿病骨質疏松患者的臨床癥狀，并且不良反應較少，治療效果顯著。葛根素治療老年女性骨質疏松癥的效果也較為突出，對成骨細胞的增殖也有一定的促進作用[7]，但是關于其作用機制的相關研究較少。本研究探討葛根素對骨質疏松大鼠成骨細胞增殖和活性的影響及作用機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取24只無特定病原體級別的3月齡且未經產的SD雌性大鼠，體重(210.5±10.2)g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產許可證:SCXK(京)2012-0001。飼養環境室溫維持在(25±1)℃，空氣相對濕度(52±3)%，通風設置8～12次/h，采用標準飼料進行喂養。本研究所做實驗均獲得我院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 葛根素注射液(山東魯抗醫藥集團賽特有限責任公司生產，國藥準字：H20046426)；RANKL抗體(武漢博士德公司提供,批號BAl323)、核因子κB受體活化因子[receptor activator of nuclear factor-κB，RANK；艾博抗(上海)貿易有限公司，批號：ab219097]、OPG多克隆抗體(Abbkine公司，批號：ABP52083)；磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered saline-Tween，PBST；蘇州亞科科技股份有限公司，批號：H0012)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及大鼠骨質疏松模型的建立：選取6只大鼠作為正常組，其余18只大鼠按隨機數字表法分為模型組、低劑量葛根素組和高劑量葛根素組，每組6只。根據文獻[8]中的方法制作骨質疏松大鼠模型。使用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，約10 min后，待大鼠明顯活動減弱、呼吸均勻、觸碰四肢無反抗，即可將大鼠背部朝上四肢固定。剔除背部毛發，用碘附常規消毒腰背部，再用酒精棉球脫碘附，在肋脊角水平位置，沿與正中腰部平行且距離正中線約2 mm處，左右對稱分別做一小切口(約3 mm)。切開肌肉進入后腹膜并且沿子宮分支找出卵巢，在輸卵管處結扎卵巢動靜脈切除卵巢，行背式卵巢去勢。依次縫合肌層及皮層，碘附消毒，待大鼠完全清醒后，放回鼠籠，觀察建模情況。大鼠運動量明顯減少，在等同外力下模型大鼠出現乏力，抽筋、骨折，則視為建模成功。其中建模成功15只，模型組、低劑量葛根素組及高劑量葛根素組各5只。

1.3.2 干預方法：建模成功后，低葛根素組、高劑量葛根素組分別給予50 mg/kg和75 mg/kg葛根素注射液皮下注射干預，正常組、模型組大鼠給予等體積的生理鹽水皮下注射干預。4組大鼠干預均1 d/次，連續干預3周。在干預過程中均正常飼養，自由飲水。

1.3.3 成骨細胞培養：干預3周后，采用斷頭法處死大鼠，放置于75%的酒精中浸泡10 min后在無菌條件下揭去頭皮，取顱蓋骨，清除表面結締組織，之后使用生理鹽水沖洗至發白，剪碎后使用5 mL 0.25%胰蛋白酶消化20 min；棄去消化液，骨片移至0.1%Ⅰ型膠原酶的消化液中消化60 min，然后棄去消化液，再次將骨片移至0.1%Ⅰ型膠原酶的消化液中消化60 min；將過濾后的消化液2 000 r/min離心5 min，棄去上清液，將沉淀的細胞加入至5 mL杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)培養液中，接種于培養皿中，在37℃、含5%二氧化碳、濕度為95%的培養箱中培養1 d后DMEM換液一次，將不貼壁的細胞清除，之后2～3 d換液一次，純化成骨細胞，培養至第3代待用。

1.3.4 四甲基偶氮唑鹽法檢測成骨細胞的增殖：將純化第3代的成骨細胞再傳1代后，使用0.25%胰蛋白酶以及0.02%乙二胺四乙酸消化計數，按2×103個/孔的密度接種在96孔板內，加入含10%小牛血清的5 mL DMEM培養基，在37℃、5%二氧化碳環境下進行培養，24 h后當細胞貼壁穩定后，采用平衡鹽溶液清洗，使用四甲基偶氮唑鹽法檢測成骨細胞增殖，試劑購自上海邦景實業有限公司(批號：BJ-0251BT)，使用酶標儀(南京貝登醫療股份有限公司，型號MR-96A)在490 nm波長處讀取A值，分析成骨細胞增殖指數。

1.3.5 對硝基苯磷酸鹽法檢測成骨細胞中ALP的活性：細胞培養同1.2.2。使用對硝基苯磷酸鹽法分析成骨細胞中ALP的活性，試劑購自上海研謹生物科技有限公司(批號：S46070-1g)使用酶標儀在405 nm波長處讀取A值，分析成骨細胞ALP活性。

1.3.6 病理學觀察：每組大鼠處死后快速截取大鼠股骨骨組織，將其置于4%的多聚甲醛中進行固定，制作常規石蠟切片，在濃度0.5%蘇木精-伊紅染色液中染色10 min，自來水沖洗1次；使用乙醇梯度進行脫水處理，最后用中性樹膠進行封片。

1.3.7 骨代謝相關指標檢測：處死大鼠前抽取大鼠腹部靜脈血3 mL，以3 000 r/min離心10 min后，分離上層血清，用于骨代謝相關指標的檢測。(1)骨鈣素水平。采用5 mmol/L碳酸鹽包被緩沖液將抗原進行溶解，濃度為10～20 μg/mL，加入96孔酶標板中，100 μL/孔，4℃過夜保存。第2天舍棄包被液，采用PBST洗滌3次，每孔中加入1%的150 μL牛血清蛋白(上海聯邁生物工程有限公司，貨號：LM-161)，在37℃環境中封閉1 h。之后采用PBST洗滌3次，在每孔中加入100 μL不同倍比稀釋度的牛血清，加入骨鈣素標準品(上海江萊生物科技有限公司，批號：JL2019-48T)，37℃孵育2 h。采用PBST洗滌5次，加入100 μL稀釋后的辣根過氧化物酶(上海源葉生物科技有限公司，貨號：9003-99-0)標記的二抗(1 ∶5 000；遠慕生物科技有限公司，批號：YM-XQ0470P)，37℃孵育1 h。PBST洗滌5次，使用顯色劑顯色20 min，在酶標儀上讀取405 nm波長處的A值，測定骨鈣素水平。(2)鈣水平：嚴格按照偶氮胂Ⅲ試劑盒及其相關試劑[由北京森美希克瑪生物科技有限公司提供，京藥監械(準)字2010第2400914號]說明書進行操作。(3)磷水平：將2 mL靜脈血放入50 mL消化管中，加入混合酸15 mL，過夜。次日，將消化管放入消化爐中，消化開始時可將溫度調低約130℃左右，然后逐步將溫度調高至240℃左右進行消化，直至可見白煙、液體變成無色或黃綠色。取樣品及空白液各2 mL加入20 mL具塞試管中，然后依次加入2 mL鉬酸銨溶液、lmL亞硫酸鈉溶液、1 mL對苯二酚溶液，加蒸餾水定容至20 mL，混勻，靜置30 min，在波長660 nm處測定其A值，并根據測出的A值在標準曲線上算得磷含量。(4)骨密度：采用雙能X線骨密度測量儀檢測大鼠股骨骨密度。

1.3.8 免疫印跡試驗檢測RANKL、RANK、OPG蛋白表達水平：干預3周后，將提取到的大鼠成骨細胞標本，研磨后加入蛋白緩沖液，進行常規蛋白提取，采用二喹啉甲酸法進行總蛋白定量分析，試劑購自北京譜析科技有限公司(批號：B4509)。50 μg的蛋白樣品上樣后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過蛋白電轉到聚偏二氟乙烯膜，使用5%的脫脂奶粉TBST緩沖液(蘇州亞科科技股份有限公司，批號：H0013)進行避光封閉1 h，洗滌之后加入一抗稀釋溶液(RANKL、RANK、OPG按照1 ∶1 000比例進行稀釋)，在4℃的環境中過夜保存；第2天使用TBST緩沖液洗滌后加入二抗稀釋溶液(按照1 ∶5 000比例進行稀釋)，在溫床中孵育1 h后再次使用TBST緩沖液洗滌，加入電化學發光液(Biochannel公司，批號：BC-WB-004-100ml)，曝光2～3次，取平均值。使用Image Lab軟件分析蛋白條帶灰度值，并計算蛋白質相對分子質量。內參蛋白為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH；抗體購自上海詩溪化工科技有限公司，批號JK40085)。

1.4 統計學分析 采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 4組大鼠成骨細胞增殖指數和ALP活性比較 高劑量葛根素組、低劑量葛根素組、正常組、模型組成骨細胞增殖指數及ALP活性均依次降低(均P<0.05)。見表1及圖1。

表1 4組大鼠成骨細胞增殖指數和ALP活性比較(x±s)

圖1 4組大鼠成骨細胞增殖指數(二甲基亞砜染色，×50)

2.2 4組大鼠股骨組織病理學變化 正常組大鼠骨組織細胞分布規則有序，細胞之間的間距小；模型組大鼠骨組織髓腔之間的間隙較大，細胞分布不規則且疏松；葛根素組大鼠骨組織細胞間隙減小，髓腔之間的間隙也逐漸縮小，其中高劑量葛根素組大鼠表現更加明顯。見圖2。

圖2 4組大鼠股骨組織病理組織學變化(蘇木精-伊紅染色，×400)

2.3 4組大鼠骨代謝相關指標比較 模型組、低劑量葛根素組、高劑量葛根素組、正常組骨密度以及血清骨鈣素水平均依次降低，模型組、低劑量葛根素組、正常組、高劑量葛根素組血清鈣和磷水平依次降低(均P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠骨代謝相關指標比較(x±s)

2.4 4組大鼠RANKL、RANK、OPG蛋白相對表達量比較 模型組、低劑量葛根素組、高劑量葛根素組、正常組RANKL、RANK蛋白相對表達量依次降低，而OPG蛋白相對表達量依次升高(均P<0.05)。見表3、圖3。

表3 4組大鼠RANKL、RANK、OPG蛋白相對表達量比較(x±s)

圖3 4組大鼠RANKL、RANK、OPG蛋白電泳圖

3 討 論

在骨代謝中，破骨細胞促進骨吸收，成骨細胞促進骨形成，當骨吸收和骨形成相對平衡時，才能維持機體正常骨量[9]。隨著年齡的增加，胰島功能逐漸降低，患骨質疏松癥的危險性逐漸增高[1]。骨質疏松有較高的致殘性，嚴重影響人們的生活質量。葛根素具有和雌激素相似的化學結構，可以起到雌激素的作用，預防絕經后骨質疏松的效果顯著，且毒副作用較小[10]。本研究中，病理組織學結果顯示，模型組大鼠骨組織髓腔之間的間隙較大，骨組織細胞分布不規則、疏松，說明建模成功。ALP作為骨形成過程的主要參與酶之一，可反映成骨細胞的分化、成熟及活性，ALP活性隨著成骨細胞分化而逐漸增強，同時也反映了成骨細胞的活性[11-12]。同時，ALP是骨基質形成的重要標志物，可以反映骨形成，評估骨轉化的情況[13]。此外，陳明等[14]研究發現，ALP通過分解磷酸酯中的無機磷，進一步促進基質發生礦化。本研究結果顯示，低劑量及高劑量葛根素組大鼠成骨細胞的增殖指數和ALP均高于模型組及正常組(均P<0.05)，說明葛根素能夠提高成骨細胞活性；而且高劑量葛根素組大鼠成骨細胞的增殖指數和ALP均高于低劑量葛根素組(均P<0.05)，說明高劑量(75 mg/kg)的葛根素可更顯著地增加ALP活性，對成骨細胞增殖的促進作用更明顯。研究表明，骨代謝標志物水平增高時，提示高骨轉換以及骨丟失加快[15]。血清鈣、磷水平是骨代謝主要的骨礦成分，兩者的含量穩定是骨吸收和骨形成平衡的重要標志[16]。本研究結果顯示，模型組大鼠血清中骨密度、骨鈣素、鈣、磷水平均高于其他3組(均P<0.05)，說明骨質疏松會導致骨轉換和骨丟失加快；而模型組、低劑量葛根素組、高劑量葛根素組骨密度、骨鈣素、鈣、磷水平依次降低(均P<0.05)，說明葛根素能夠降低大鼠骨密度以及血清骨鈣素、鈣、磷含量，維持骨吸收和骨形成的平衡，且高劑量(75 mg/kg)的葛根素作用更為顯著。

RANKL/RANK/OPG相關通路是骨吸收和骨形成過程中重要的調節通路，其中OPG蛋白是唯一與成骨細胞膜上RANKL相結合的受體，主要作用是在RANKL和RANK結合的過程中起到抑制作用，從而阻斷破骨細胞前體發生分化和融合，對成熟的破骨細胞有明顯的抑制作用，從而對破骨細胞的凋亡起到一定的抑制作用[16-17]。研究表明，成骨細胞受到骨吸收的刺激后會促進RANKL分泌，而RANKL可以與破骨前體細胞表面的RANK結合，激活核因子κB通路，從而促進成熟的破骨細胞分化形成[18-19]。成骨細胞經過成骨相關因子的刺激，會促進OPG分泌，與RANKL競爭與RANK受體結合，對破骨細胞的形成以及活性起到一定的抑制作用[20]。本研究結果顯示，模型組、低劑量、高劑量葛根素組大鼠的RANKL、RANK相對表達量依次降低，而OPG相對表達量依次升高(均P<0.05)，提示葛根素可能通過調控RANKL/RANK/OPG相關通路，從而發揮對骨質疏松大鼠成骨細胞活性的促進作用。

綜上所述，葛根素可以促進骨質疏松大鼠成骨細胞增殖，提高成骨細胞活性，維持骨吸收和骨形成的平衡，其機制可能與調控RANKL/RANK/OPG相關通路蛋白的表達有關。