黑色素瘤缺乏因子2在缺氧復氧損傷介導的肝細胞焦亡中的作用▲

李春桃 唐蘇婷 喻淋淋 徐云柯 郭 勇 李 波

(1 西南醫科大學附屬中醫醫院肝膽外科，四川省瀘州市 646000，電子郵箱：373632809@qq.com；2 西南醫科大學附屬醫院肝膽外科，四川省瀘州市 646000)

肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)是各種臨床病理過程和肝臟手術的主要并發癥，例如失血性休克、創傷、肝移植和肝切除術[1-3]。由于激活了氧化應激、免疫應答和細胞凋亡等過程，HIRI具有高發病率和高死亡率的特征[4-6]。目前，臨床上采用缺血預處理和藥物制劑來預防和減輕HIRI[7]，但是缺血預處理并不適用于所有HIRI患者，且目前可用的藥物制劑對HIRI的療效也有限[8]。目前尚無有效、規范的方法用于預防和減輕HIRI[9]。因此，明確HIRI發展的作用機制顯得尤為迫切。

細胞焦亡由Zychlinsky等[10]發現并命名，是一種有別于細胞凋亡的細胞程序性死亡，其典型特征是細胞膜快速破裂以及促炎因子的釋放[11]。目前，已經在腦、心臟、腎臟、肝臟等多種臟器缺血再灌注損傷中發現了細胞焦亡的現象[12-18]。由此推測細胞焦亡參與HIRI的發生發展并可能發揮重要作用。黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)屬于具有200個氨基酸重復序列的造血干擾素誘導性核抗原家族，蛋白質編碼區全長1 032 bp，共編碼344個氨基酸，能響應外源性病原微生物以及內源性免疫應激，形成炎性體復合物，誘導細胞焦亡[19]。已有研究表明，HIRI小鼠肝組織中的AIM2蛋白表達水平上調[20]。然而，AIM2在HIRI介導的細胞焦亡中是否發揮作用尚不清楚。本研究利用缺氧復氧干預L02細胞系以構建HIRI體外模型，探究AIM2在缺氧復氧損傷介導的肝細胞焦亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 人正常肝細胞系L02購自武漢普諾賽生命科技有限公司。RPMI-1640培養基(批號：42401042)、胎牛血清(批號：10099133C)、青鏈霉素雙抗(批號：15070063)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS；批號：10010023)購自美國Gibco公司；細胞計數檢測(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒購自日本DOJINDO公司(批號：CK04)；FAM-FLICA半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-1試劑盒購自美國ImmunoChemistry Technologies公司(批號：1904D)；組織裂解液(批號：R0010)以及高效化學發光試劑盒(批號：SW2020)購自北京索萊寶科技有限公司。二喹啉甲酸試劑盒(批號：23227)、Lipofectamine 3000轉染試劑(批號：L3000015)、針對AIM2的小干擾RNA(si-AIM2，批號：4392420)以及相應的陰性對照(si-NC，批號：4457287)購自美國Thermo Fishier Scientific公司；抗Caspase-1兔多克隆抗體(批號：ab1872)、抗AIM2兔多克隆抗體(批號：ab93015)、抗白細胞介素(interleukin，IL)-1β兔單克隆抗體(批號：ab9722)、抗IL-18兔多克隆抗體(批號：ab191152)、抗β-肌動蛋白兔多克隆抗體(批號：ab5694)以及辣根過氧化物標記的山羊抗兔IgG二抗(批號：ab205718)均購自英國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：L02細胞培養于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的培養瓶中，放置于5%二氧化碳、37℃恒溫細胞培養箱內。每2 d換液1次，當細胞長至90%融合狀態時進行傳代。

1.2.2 缺氧復氧細胞模型的建立：將部分L02細胞接種在6孔板中(1×106個/孔)，常規培養24 h，400倍AE31型倒置顯微鏡(廈門麥克奧迪實業有限公司)下觀察細胞并收集細胞備用，設為空白對照。其余L02細胞轉入缺氧環境培養箱中，條件設置為37℃、1% O2、5%二氧化碳、94% N2，培養6 h后，將細胞轉至37℃、5%二氧化碳、95%空氣的恒溫培養箱中復氧培養，分別在復氧1 h、3 h、6 h、12 h、24 h后在400倍顯微鏡下觀察并收集細胞備用。

1.2.3 si-AIM2、si-NC轉染L02細胞：按照說明書的操作步驟，用Lipofectamine 3000轉染試劑分別將si-AIM2、si-NC轉染L02細胞，分別作為缺氧復氧+si-AIM2組、缺氧復氧+si-NC組。轉染6 h后，更換為含10%胎牛血清但不含雙抗的培養基繼續培養6 h，之后進行缺氧培養6 h，復氧培養12 h并收集細胞備用，缺氧、復氧的方法同1.2.2。另取L02細胞分別作為缺氧復氧模型組、空白對照組，均不進行轉染，前者采用1.2.2的方法進行缺氧培養6 h、復氧培養12 h，而后者則在常氧條件下培養等量時長，最后收集細胞備用。

1.2.4 細胞活性測定：采用CCK-8法檢測細胞活性。將L02接種到96孔板中(7×103個/孔)，預培養24 h，然后分別按照1.2.2及1.2.3對細胞進行分組及處理后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，避光孵育3 h。將MK3全自動酶標儀(美國Thermo Fisher公司)設置在450 nm波長并記錄OD值。實驗重復4次。

1.2.5 細胞焦亡率測定：采用流式細胞術檢測細胞焦亡率。參照文獻[21]，根據L02細胞中活化的Caspase-1和碘化丙啶的雙陽性染色情況來評估細胞焦亡情況。收集經1.2.2及1.2.3步驟干預后的L02細胞，用1 mL胰酶在37℃條件下消化1 min。消化后吸出胰酶，加入PBS，在室溫條件下1 000 r/min離心5 min，吸出PBS，重復3次。PBS重懸細胞，用FAM-FLICA Caspase-1和碘化丙啶對細胞進行雙染色，按照試劑盒說明書進行操作。然后通過FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)進行檢測。實驗重復3次。

1.2.6 蛋白免疫印跡實驗：收集經1.2.2及1.2.3步驟干預后的L02細胞，用裂解液裂解并提取蛋白質，使用二喹啉甲酸試劑盒進行蛋白定量，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對定量的蛋白進行分離。將分離的蛋白轉到聚偏氟乙烯膜上，再將聚偏氟乙烯膜用5%脫脂乳封閉1 h，在4℃條件下將封閉后的聚偏氟乙烯膜分別與抗AIM2(1 ∶1 000)、Caspase-1(1 ∶1 000)、IL-1β(1 ∶1 000)、IL-18(1 ∶500)、β-肌動蛋白(1 ∶200)的一抗共同孵育過夜，之后與二抗(1 ∶5 000)在室溫下孵育1 h，用高效化學顯影試劑盒使條帶可見，利用Image-Pro Plus 6.0軟件統計蛋白條帶灰度，根據β-肌動蛋白灰度值對定量結果進行歸一化處理。實驗重復3次。

1.3 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同復氧時間下L02細胞的形態 隨缺氧后復氧時間的延長，L02細胞的形態損傷逐漸加劇，漂浮細胞團塊逐漸增多。見圖1。

圖1 缺氧后復氧對L02細胞狀態的影響

2.2 不同復氧時間下L02細胞的活性 與空白對照組、缺氧復氧1 h組、缺氧復氧3 h組相比，缺氧復氧6 h、12 h、24 h組細胞活力下降(P<0.05)。缺氧復氧6 h、12 h、24 h組細胞活力依次下降(均P<0.05)。見表1。

表1 不同復氧時間對L02細胞活力的影響(x±s)

2.3 不同復氧時間下L02細胞的焦亡情況 與空白對照組比較，缺氧復氧 3 h、6 h、12 h、24 h組的Caspase-1/碘化丙啶陽性率上升(P<0.05)；與缺氧復氧1 h、3 h組比較，缺氧復氧6 h、12 h、24 h組的Caspase-1/碘化丙啶陽性率上升；缺氧復氧6 h、12 h、24 h組的Caspase-1/碘化丙啶陽性率依次上升(均P<0.05)。見圖2和表2。

表2 不同復氧時間L02細胞Caspase-1/碘化丙啶陽性率比較(x±s，%)

圖2 缺氧復氧對L02細胞Caspase-1/碘化丙啶陽性率的影響

2.4 不同復氧時間下L02細胞AIM2蛋白及焦亡相關蛋白表達情況 與空白對照組相比，缺氧復氧3 h、6 h、12 h、24 h組的AIM2蛋白表達水平上升(均P<0.05)；與缺氧復氧1 h組相比，缺氧復氧12 h、24 h組AIM2蛋白表達水平上升(均P<0.05)。與缺氧復氧3 h組相比，缺氧復氧24 h組AIM2蛋白表達水平上升(均P<0.05)；與空白對照組相比，缺氧復氧 6 h、12 h、24 h組的焦亡標志物Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達水平上升(均P<0.05)；與缺氧復氧1 h組相比，缺氧復氧12 h、24 h組的Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達水平上升(均P<0.05)；與缺氧復氧3 h組相比，缺氧復氧12 h組的IL-1β以及缺氧復氧24 h組的Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達水平上升(均P<0.05)；與缺氧復氧6 h組相比，缺氧復氧24 h組Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達水平上升(均P<0.05)；與缺氧復氧12 h組相比，缺氧復氧24 h組Caspase-1、IL-1β表達水平上升(均P<0.05)。見表3和圖3。

表3 不同復氧時間L02細胞AIM2、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白相對表達水平比較(x±s)

圖3 缺氧復氧對L02細胞AIM2、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達的影響

2.5 干擾AIM2基因對缺氧復氧后L02細胞活性的影響 與空白對照組相比，缺氧復氧模型組、缺氧復氧+si-NC組、缺氧復氧+si-AIM2組細胞活性下降(P<0.05)；缺氧復氧模型組和缺氧復氧+si-NC組細胞活性比較，差異無統計學意義(P>0.05)；而與缺氧復氧模型組、缺氧復氧+si-NC組相比，缺氧復氧+si-AIM2組細胞活性上升(P<0.05)。見表4。

表4 4組L02細胞活性比較(x±s)

2.6 干擾AIM2基因對缺氧復氧后L02細胞焦亡 與空白對照組相比，缺氧復氧模型組、缺氧復氧+si-NC組、缺氧復氧+si-AIM2組Caspase-1/碘化丙啶陽性率升高(P<0.05)；缺氧復氧模型組和缺氧復氧+si-NC組Caspase-1/碘化丙啶陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與缺氧復氧模型組、缺氧復氧+si-NC組相比，缺氧復氧+si-AIM2組的Caspase-1/碘化丙啶陽性率降低(P<0.05)。見表5和圖4。

表5 4組L02細胞Caspase-1/碘化丙啶陽性率比較(x±s，%)

圖4 干擾AIM基因2對缺氧復氧下L02細胞Caspase-1/碘化丙啶陽性率的影響

2.7 干擾AIM2基因對缺氧復氧后L02細胞Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達水平 與空白對照組相比，缺氧復氧模型組、缺氧復氧+si-NC組的Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達水平，以及缺氧復氧+si-AIM2組的Caspase-1、IL-18蛋白表達水平升高(均P<0.05)；缺氧復氧模型組和缺氧復氧+si-NC組的Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與缺氧復氧模型組相比，缺氧復氧+si-AIM2組Caspase-1、IL-1β蛋白水平降低(均P<0.05)；與缺氧復氧+si-NC組相比，缺氧復氧+si-AIM2組Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達水平均下降(均P<0.05)。見圖5和表6。

圖5 干擾AIM2對缺氧復氧下L02細胞Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達的影響

表6 4組L02細胞Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

HIRI常見于肝臟切除或肝移植手術中，目前仍缺乏有效的干預手段[22]。細胞焦亡途徑可能是HIRI發生的關鍵機制，但在細胞層面上HIRI與細胞焦亡的關系，尚未見有研究報道。本研究通過對正常肝細胞系L02進行缺氧復氧處理以建立HIRI體外模型，發現隨缺氧后復氧時間的延長，L02細胞的形態損傷逐漸加劇，漂浮細胞團塊逐漸增多，CCK-8檢測發現，與空白對照組、缺氧復氧1 h組、缺氧復氧3 h組相比，缺氧復氧 6 h、12 h、24 h組細胞活力下降(P<0.05)，提示HIRI體外模型構建成功，可用于后續研究。

細胞焦亡是新發現的一種伴隨炎癥的細胞程序性裂解死亡[23]。已有研究證實，細胞焦亡依賴于胱天蛋白酶家族的激活，其中經典通路是Caspase-1激活并切割促炎性細胞因子前體以產生大量活性形式的IL-1β和IL-18[24]。此外，Caspase-1還可以切割熱解成孔蛋白-消皮素D，產生消皮素D的N端和C端，其中N端可以轉移至細胞膜，與細胞膜上的磷脂蛋白結合，觸發細胞膜穿孔，促進炎性因子的釋放從而引發細胞焦亡[25-26]。本研究參照相關文獻[21]，以Caspase-1和碘化丙啶雙陽性率來評估細胞焦亡率，結果顯示，與空白對照組比較，缺氧復氧 3 h、6 h、12 h、24 h組的Caspase-1/碘化丙啶陽性率上升；缺氧復氧6 h、12 h、24 h組的Caspase-1/碘化丙啶陽性率高于缺氧復氧1 h、3 h組，且依次升高(P<0.05)。這提示隨缺氧后復氧時間的增加，Caspase-1/碘化丙啶陽性率總體呈上升趨勢，表明L02細胞的細胞焦亡與缺氧后復氧有關。

AIM2是胞質雙鏈DNA的傳感器，被病原微生物雙鏈DNA或自身免疫激活后，與細胞凋亡相關斑點樣蛋白和Caspase-1前體組成炎性小體復合物，剪切炎性細胞因子IL-1β前體和IL-18前體，并引發細胞焦亡[27-28]。Gao等[19]發現，由AIM2介導的細胞焦亡在放射性肺損傷中發揮重要作用，抑制AIM2的活化可以減輕放射性肺損傷。Liang等[29]則提出，抑制AIM2活性可以改善腦缺血再灌注損傷。本研究結果顯示，復氧6～24 h后，L02細胞AIM2蛋白和焦亡相關蛋白Caspase-1、IL-1β和IL-18表達水平升高，尤其是復氧24 h后，L02細胞以上蛋白的表達水平高于2個或2個以上不同復氧時間組，表明隨著缺氧復氧時間的增加，細胞焦亡不斷加劇，同時AIM2可能參與了細胞焦亡。

然而，缺氧復氧造成的細胞焦亡是否由AIM2介導還需要進一步驗證。本研究進一步應用小干擾RNA內源性干擾AIM2基因的表達，結果顯示，與缺氧復氧模型組和缺氧復氧+si-NC組比較，缺氧復氧+si-AIM2組細胞活性升高，而Caspase-1/碘化丙啶陽性率、焦亡相關蛋白Caspase-1和IL-1β的表達水平均降低(P<0.05)，但缺氧復氧模型組和缺氧復氧+si-NC組之間差異并無統計學意義(P>0.05)；且缺氧復氧+si-AIM2組焦亡相關蛋白IL-18的表達水平亦低于缺氧復氧+si-NC組(P<0.05)。提示缺氧復氧引起的細胞焦亡與AIM2的活化有關，AIM2可能通過Caspase-1及炎性細胞因子誘發細胞焦亡。

綜上所述，AIM2參與缺氧后復氧誘導的L02細胞焦亡；干擾AIM2基因的表達可能通過抑制Caspase-1、IL-1β、IL-18的表達水平來改善缺氧后復氧引起的L02細胞焦亡。