急性冠狀動脈綜合征患者血漿miR-375 水平與預后的關系

陸 宏，陶 杰，李家宇

近年來，隨著我國人口老齡化進程加快，急性冠狀動脈綜合征 （acute coronary syndrome，ACS）發(fā)病率和死亡率逐年增加，且有年輕化發(fā)展趨勢［1-2］。隨著介入技術發(fā)展，經皮冠狀動脈介入治療（PCI）已成為ACS 治療的主要方法之一［3］，但仍有部分患者發(fā)生主要心血管不良事件（MACE）［4］。 因此，探究預判ACS 患者PCI 術后預后的標志物有著重要意義。 微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）是一種由 18～22 個核苷酸組成的單鏈非編碼 RNA［5］。 目前多數研究報道 miRNA 與 ACS 發(fā)病或預后有關［6-7］，如miR-21 與 ACS 斑塊穩(wěn)定性有關［8］。 miR-375 作為miRNA 家族成員，已被報道可抑制Notch 信號通路表達［9］。 眾所周知，Notch 信號通路抑制可導致心肌細胞凋亡增加，加劇心臟肥厚和心肌纖維化［10］。 基于上述研究，本研究推測miR-375 靶向Notch 信號通路參與心肌細胞調節(jié)，進而影響ACS 患者預后。本研究通過分析miR-375 與ACS 患者預后的關系，以期為預防MACE 發(fā)生提供參考。 現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2016年3月至 2017年4月在昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院接受治療的206 例ACS 患者作為研究對象。 參照《急性冠脈綜合征急診快速診療指南》［11］診斷 ACS。 患者納入標準：①首次確診為ACS；②接受 PCI 治療；③ACS 發(fā)病后 48 h 內入院；④配合完成相關檢查；⑤簽署知清同意書。 排除標準：①接受冠狀動脈旁路移植術治療；②不接受PCI治療；③伴有擴張性心肌病、心瓣膜病、肥厚型心肌病；④伴有慢性阻塞性肺疾病、外周血管疾病、胸主動脈瘤、腦卒中、自身免疫性疾病或惡性腫瘤等；⑤肝、腎功能異常；⑥高同型半胱氨酸血癥；⑦隨訪失聯。 206 例 ACS 患者中男 134 例，女 72 例；年齡29～69 歲，平均（56.28±9.21）歲。本研究經昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 信息收集

收集所有患者年齡、性別、體質指數（BMI）、疾病史（高血壓史、高脂血癥史、糖尿病史等）、ACS 家族史、ACS 類型［ST 段抬高型心肌梗死（STEMI）、非ST 段抬高型心肌梗死（NSTEMI） 和不穩(wěn)定心絞痛（unstable angina，UA）］、血管病變位置及支數等信息。

1.3 血漿miR-375 水平檢測

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）法檢測 ACS 患者血漿 miR-375 水平［12］。 分別抽取 ACS患者入院24 h 內和PCI 術后7 d 空腹外周靜脈血，4 000 r/min 離心15 min，離心半徑為8 cm，提取離心后上清液。 將TRIzol 試劑加至裝有上清液試管中提取總RNA，用紫外分光光度計檢測總RNA 純度，若A260/A280 在1.8～2.1，則用逆轉錄試劑盒將其轉錄成cDNA，最后用PCR 儀擴增cDNA，擴增條件為 95℃ 15 min，94℃ 15 s，55℃ 30 s，70℃ 30 s，共 40 個循環(huán)。 內參為 3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH），用 2-DDct 計算 miR-375 水平。 引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 隨訪與預后評價

采用復診和電話隨訪了解ACS 患者預后清況。患者出院后隨訪3年，每月1 次，末次隨訪時間為2020年4月 8 日。 本研究將隨訪中發(fā)生 MACE 定義為預后不良。 MACE 包括再發(fā)心肌梗死、 不穩(wěn)定心絞痛、支架內再狹窄、靶血管血運重建及心源性死亡等。

1.5 統計學分析

采用SPSS 23.0 軟件進行統計學分析。 正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差（）表示，兩組間比較用獨立樣本t 檢驗，組內比較用配對樣本t 檢驗。計數資料以例表示，組間比較用χ2檢驗。 采用受試者工作特征曲線（ROC）評價miR-375 診斷ACS 預后的效能，Kaplan-Meier 法繪制高miR-375 組和低miR-375 組患者生存曲線，Log-Rank 法進行比較。采用Cox 回歸法分析影響ACS 預后的因素，限制性立方樣條擬合Cox 回歸分析miR-375 與ACS 預后的關系，R3.6.3 軟件繪制限制性立方樣條圖。 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ACS 患者預后清況

206 例 ACS 患者 PCI 術后有 71 例 （34.5%）預后不良，包括再發(fā)心肌梗死28 例（13.6%）、不穩(wěn)定心絞痛 15 例（7.3%）、支架內再狹窄 15 例（7.3%）、靶血管血運重建 9 例（4.4%）、心源性死亡 4 例（1.9%）。

2.2 PCI 術后血漿miR-375 水平變化

根據PCI 術后是否發(fā)生MACE，將ACS 患者分為預后不良組（n=71）和預后良好組（n=135）。 兩組PCI 術后血漿miR-375 水平均降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；預后不良組PCI 術后血漿miR-375水平高于預后良好組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表 2 ACS 患者 PCI 術前后血漿 miR-375 水平比較

表 2 ACS 患者 PCI 術前后血漿 miR-375 水平比較

組別 術前 術后 t 值 P 值預后不良組（n=71） 4.35±0.79 3.28±0.66 10.039 ＜0.001預后良好組（n=135） 4.28±0.68 2.31±0.64 24.005 ＜0.001 t 值 0.665 10.121 P 值 0.507 ＜0.001

2.3 血漿miR-375 評價ACS 預后的效能

PCI 術后血漿 miR-375 診斷 ACS 預后 ROC曲線下面積、最佳截斷點和靈敏度、特異度分別為0.862（95%CI=0.807～0.906）、2.62 和 87.32%、74.81%，PCI 術前血漿miR-375 診斷 ACS 預后 ROC 曲線下面積、 最佳截斷點和靈敏度、 特異度分別為0.513（95%CI=0.443～0.583） 和 3.90 和 63.38%、23.70%，PCI 術后血漿 miR-375 診斷 ACS 預后的效能高于PCI 術前血漿miR-375，差異有顯著統計學意義（Z=7.046，P＜0.001），見圖 1。

圖 1 血漿 miR-375 診斷 ACS 預后 ROC 曲線

2.4 兩組基線資料比較

根據PCI 術后血漿miR-375 診斷ACS 預后的最佳截斷點，將患者分為高miR-375 組（＞2.62，n=96）和低 miR-375 組（≤2.62，n=110）。 兩組年齡、性別、BMI、高血壓史、糖尿病史、高脂血癥史、ACS 家族史、ACS 類型、病變位置和病變支數比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表 3。

2.5 兩組生存清況比較

低 miR-375 組平均生存時間為35.25（34.62～35.88）個月，高于高 miR-375 組［24.22（22.04～26.40）個月］，差異有顯著統計學意義（χ2=81.614，P＜0.001）。見圖2。

表3 兩組基線資料比較

圖2 兩組生存曲線

2.6 影響ACS 預后的因素分析

將ACS 患者預后作為因變量，年齡、 性別、BMI、高血壓史、糖尿病史、高脂血癥史、ACS 家族史、ACS 類型、病變位置、病變支數和miR-375 作為自變量，納入Cox 單因素回歸分析，結果顯示高脂血癥史、 糖尿病史、ACS 家族史、 病變位置和miR-375與 ACS 預后相關（P＜0.05）。 按納入標準 P＜0.1 將年齡、高脂血癥史、糖尿病史、ACS 家族史、病變位置和miR-375 作為自變量納入Cox 多因素分析，結果顯示ACS 家族史和miR-375 是ACS 預后的獨立危險因素（P＜0.05），見表 4。

2.7 血漿miR-375 水平與ACS 預后的關系

采用限制性立方樣條擬合Cox 回歸法，對ACS 家族史進行調整后分析血漿miR-375 水平與ACS 預后的關系。 通過比較不同節(jié)點個數所對應模型Akaike 信息準則（AIC）值，確定節(jié)點個數為4 時所對應 AIC 值最小（AIC=628.938）。 分析結果顯示血漿miR-375 水平與ACS 預后明顯相關（χ2=87.37，P＜0.001），且呈線性關系（非線性檢驗χ2=4.13，P=0.127）。 以 miR-375 診斷 ACS 預后的最佳截斷點為參考點，miR-375 ＜2.62 時，與miR-375=2.62 比較，發(fā)生預后不良的風險較低；miR-375＞2.62 時，發(fā)生預后不良的風險增加。 見圖3。

表4 Cox 回歸分析影響ACS 患者預后的因素

圖3 miR-375 與ACS 預后的限制性立方樣條圖

3 討論

傳統ACS 預后預測指標多為C 反應蛋白、血清胱抑素C 及全球急性冠狀動脈事件注冊研究（GRACE）評分等，但上述指標在ACS 預后評估中價值均有限。 何東旭等［13］研究顯示 C 反應蛋白評價ACS 患者預后的ROC 曲線下面積僅為0.634，診斷效能有限。C 反應蛋白在多數炎癥性疾病中均表達，單獨用來評價ACS 預后特異度較低。 血清胱抑素C和GRACE 評分在ACS 預后評估中的價值也有限。王革等［14］采用血清胱抑素 C 和 GRACE 評分評價ACS 患者預后，結果顯示兩者診斷 ACS 預后的ROC 曲線下面積分別為0.748 和0.679，診斷效能有限。 因此，還需探究診斷效能較高的生物標志物用于ACS 預后評價。

MiR-375 位于人染色體 2q35 區(qū)域 Cryba 2 和Ccdc 108 基因片段上［15］。 目前關于 miR-375 報道越來越多，且已證實與肝細胞肝癌［16］、胃癌［17］、前列腺癌［18］及宮頸癌［19］發(fā)病和進展有關。 然而目前尚缺乏關于miR-375 與ACS 患者PCI 后預后關系的研究。本研究通過比較ACS 患者PCI 術前與術后血漿miR-375 水平，發(fā)現 ACS 患者 PCI 術后血漿 miR-375 水平降低，預后不良組血漿miR-375 水平高于預后良好組，提示miR-375 可能參與了ACS 發(fā)病和進展過程，檢測其水平有望預判ACS 預后；通過構建 miR-375 診斷 ACS 預后的 ROC 曲線，發(fā)現 PCI術后miR-375 診斷ACS 預后的ROC 曲線下面積、靈敏度、特異度分別為0.862、87.32%、74.81%，表明PCI 術后miR-375 診斷ACS 預后的效能較高，但特異度較低，可輔助評價ACS 預后；通過進一步比較高miR-375 組和低miR-375 組患者生存清況，發(fā)現低miR-375 組平均生存時間高于高miR-375 組，進一步證實本研究推測miR-375 參與了ACS 進展，檢測其水平可反映ACS 預后；通過Cox 回歸法分析影響ACS 預后的相關因素，發(fā)現ACS 家族史和miR-375 是ACS 預后的獨立危險因素；進一步通過限制性立方樣條分析miR-375 與ACS 患者預后的關系，發(fā)現miR-375 與ACS 預后不良存在線性關系，且預后不良風險隨其水平增加而增加。 上述結果表明miR-375 水平高的ACS 患者預后不良風險較高，應予以密切觀察、隨訪，避免MACE 發(fā)生。

Notch 信號轉導通路是決定細胞命運的重要信號轉導通路之一，參與細胞凋亡、分化及增殖過程，對器官形成和形態(tài)有影響作用［20］。 心肌細胞損傷后Notch 信號激活可發(fā)揮保護作用［10］。 此外，Notch 信號還與血管內皮損傷后引起的血管內再狹窄有關，Notch 1 信號激活后可促進血管平滑肌細胞增殖和遷移，通過上述機制參與新生內皮增殖過程，進而促使血管再狹窄發(fā)生［21-22］。 然而 miR-375 可通過調控Notch 信號通路參與 P19 細胞向心肌細胞分化［10］。 本研究推測miR-375 通過Notch 信號通路，一方面調控心肌細胞凋亡、分化及增殖過程，進而影響心肌纖維化和心肌肥厚，另一方面參與血管內再狹窄過程。 上述病理機制推測仍需實驗研究進一步闡明。基于上述推測，檢測miR-375 水平可能有助于了解心肌細胞凋亡或纖維化等程度，進而反映ACS 患者預后。

本研究不足之處，一是單中心研究，難免因地域問題對實驗結果造成一定偏倚；二是未能動態(tài)評估ACS 患者血漿miR-375 水平；三是未開展基礎研究闡明miR-375 影響ACS 預后不良的病理機制。下一步將針對不足進行補充，充實本研究內容。

綜上所述，ACS 患者PCI 術后血漿miR-375 水平高提示預后不良風險較高，檢測PCI 術后ACS 患者血漿miR-375 水平有助于了解預后，避免MACE 發(fā)生。