醛糖還原酶抑制劑對糖尿病周圍神經病變患者NLRP3炎性體表達的影響

蔣鳳，朱靜和，劉青員，于建秀

濱海縣人民醫院內分泌科1、檢驗科2，江蘇 鹽城 224500

糖尿病周圍神經病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病的一種微血管并發癥，患病率約為30%，而高達50%的患者在患病期間肯定會發展成神經病變[1]。高血糖在糖尿病神經病變的發病機制中起著重要作用，它通過激活醛糖還原酶導致山梨醇水平升高，導致周圍神經細胞損傷和肌醇降低，從而導致神經傳導所必需的Na+/K+-ATP酶活性降低[2]。最近的研究表明，NLRP3 炎性體介導的免疫反應激活與各種繼發性糖尿病并發癥以及糖尿病引起的炎癥性并發癥(如心血管疾病)的病理生理有關[3-4]。但高血糖誘導的先天免疫反應在糖尿病周圍神經病變中的作用尚不清楚。本研究通過調查醛糖還原酶抑制劑對高糖誘導的單核細胞NLRP3 炎性體的調控，探討其在糖尿病周圍神經病變發生發展過程中的潛在治療作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2019 年7 月至2020年1月濱海縣人民醫院內分泌科收治的90例2型糖尿病(T2DM)患者的臨床資料，其中DPN組患者45例，非DPN (NDPN)組患者45 例，同時選取同期在本院體檢的健康人群45例作為對照組。DPN診斷標準符合《中國糖尿病防治指南》[5]中的診斷標準，對照組下肢神經傳導檢查顯示無多神經病變。排除標準：中毒性周圍神經病變、重癥肌無力等神經系統疾病；系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎等血管炎性疾病；急性傳染病者；近期服用營養神經、抗氧化藥物等；整體狀態差無法配合檢查者。三組受檢者在年齡、性別、體質量指數(BMI)方面比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性，見表1。本研究獲得醫院倫理委員會批準(批準號2019-03)，所有受檢者均簽署知情同意書。

表1 三組受檢者的臨床資料比較(±s)

表1 三組受檢者的臨床資料比較(±s)

注：分別與對照組比較，aP＜0.05。

組別DPN組NDPN組對照組t/F/χ2值P值例數45 45 45年齡(歲)61.05±5.03 60.21±4.88 59.83±4.61 0.747 7 0.475 4男/女(例)25/20 23/22 23/22 0.237 7 0.888 0 BMI (kg/m2)24.41±3.26 24.37±3.15 23.57±3.06 1.013 0.365 8病史(年)12.34±2.53 11.51±2.33-1.619 0.109 1空腹血糖(mmol/L)9.11±3.25a 8.63±3.07a 4.77±1.65 33.65＜0.01糖化血紅蛋白(%)8.34±2.79a 8.12 ±2.68a 5.36±2.31 18.34＜0.01

1.2 儀器和試劑 實時定量PCR儀7500、cDNA反轉錄試劑盒及QuantiTect SYBR Green PCR 試劑盒均 購 自Applied Biosystems；Trizol 購 自Invitrogen 公司；采用上海恒信公司提供的Ficoll-HyPaque 分離液分離外周血單個核細胞(PBMCs)；D-葡萄糖粉購自Sigma 公司；RPMI 1640 購自美國Gibco；細胞因子IL-1β及IL-18檢測試劑盒購自美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 外周血采集 抽取三組受檢者靜脈血8 mL，4 mL 離心分離血清，用于空腹血糖及胰島素檢測；剩余2 mL 全血用于糖化血紅蛋白檢測，2 mL 離心分離血清，存于-80℃，用于批量檢測IL-1β、IL-18濃度。

1.3.2 Liminex200 檢測三組受檢者血清IL-1β、IL-18 濃度 取出上述-80℃保存的血清，室溫融化，根據試劑說明書提供的操作步驟檢測組患者血清IL-1β、IL-18濃度，每個標本檢測兩次，取均值。

1.3.3 RT-PCR法檢測三組受檢者PBMCs中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA 水平 采用Ficoll-HyPaque分離液制備PBMCs，Trizol試劑提取PBMC中總RNA，然后通過cDNA 反轉錄試劑盒將及QuantiTect SYBR Green PCR 試劑盒擴增NLRP3、ASC、Caspase-1。引物設計如下：NLRP3，正義鏈：GCTGCGATCAACAGGAGAGA，反 義 鏈：GCTCACACTCTCACCCAGA；ASC，正義鏈：AAGCCAGGCCTGCACTTTAT，反義鏈：AGAGCTTCCGCATCTTGCTT；Caspase-1，正義鏈：CATCCCACAATGGGCTCTGT，反義鏈：TTCACTCTTTCAGTGGTGGGC；β-actin ：正義鏈：GGGAAATCGTGCGTGACATT 反義鏈：GGAAG GAAGGCTGGAAGAGT。PCR 反應條件如下：50℃2 min，95℃預變性2 min，95℃預變性15 s，60℃預變性1 min，共40個循環。采用2-ΔΔCT方法評估歸RNA水平(19)。95℃15 min，95℃15 s，60℃15 s，72℃35 s 40 個循環。mRNA 相對表達水平通過比較Ct 方法計算，即相對量=2-ΔΔCt。

1.4 高糖刺激培養PBMCs 抽取5 例DPN 患者空腹靜脈血20 mL，采用Ficoll-HyPaque 分離液制備PBMCs，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，置37℃，5%CO2培養箱2 h，去除未貼壁細胞，PBS 洗滌。細胞經特異性單抗CD14 孵育后，采用流式細胞儀鑒定單核細胞純度，陽性率達90%。用含有10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基重懸細胞，再將細胞以1×105個/mL的濃度接種至12 孔板中培養48 h，分為三組：空白組(5 mmol/L 葡萄糖)、高糖處理組(HG，25 mmol/L 葡萄糖)、非達司他+HG 組(Fid 10 μmol/L+25 mmol/L 葡萄糖)。培養48 h 后收集細胞，通過RT-PCR 法檢測各組NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA，IL-1β mRNA (正義鏈：CTCCGACCACCACTACAGCAA，反義鏈：CAACACGCAGGACAGGTACAG)、IL-18 mRNA( 正義鏈：TGCATCAACTTTGTGGCAAT，反義鏈：ATAGAGGCCGATTTCCTTGG)表達。

1.5 統計學方法 應用GraphPad Prism6 軟件對各種數據進行分析，性別采用χ2檢驗；正態分布數據以均數±標準差(±s)，兩組比較采用t檢驗，三組比較采用單因素方差分析；偏態資料采用中位數[M (P25～P75)]表示，兩組數據比較采用Mann-Whitney U 檢驗，三組數據比較采用Kruskai-wallis 檢驗；采用Pearson 進行相關性分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組受檢者的血清IL-1β、IL-18水平比較 與對照組相比，DPN 及NDPN 組血清IL-1β、IL-18 濃度均升高，且NDPN 組升高更為明顯，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 三組受檢者的血清IL-1β、IL-18水平比較[M (P25～P75)，pg/mL]

2.2 三組受檢者PBMCs 中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA表達水平比較 與對照組相比，NDPN組及DPN組患者PBMCs中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA 表達升高，且NLRP3 mRNA表達在DPN組升高更為明顯，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 三組受檢者PBMCs中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA表達[M (P25～P75)]

2.3 DPN患者NLRP3炎性體與相關細胞因子相關性 DPN 患者PBMCs 中NLRP3 與IL-1β、IL-18 呈正相關(P＜0.05)；ASC 與IL-1β 、IL-18 呈正相關(P＜0.05)；Caspase-1 與IL-1β、IL-18 呈正相關(P＜0.05)，見表4。

表4 DPN患者NLRP3炎性體與相關細胞因子的相關性

2.4 醛糖還原酶抑制劑非達司他抑制高糖誘導的PBMCs 中炎性體表達 體外通過醛糖還原酶抑制劑非達司他刺激培養PBMCs，與空白組相比，HG 組PBMCs 中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1 mRNA及IL-18 mRNA表達升高，差異有統 計 學 意 義(P＜0.05)；與HG 組 相 比，Fid + HG 組PBMCs 中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1 mRNA及IL-18 mRNA表達降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表5。

表5 醛糖還原酶抑制高糖誘導的DPN患者PBMCs中炎性體表達[M (P25～P75)]

3 討論

糖尿病是一種全球性的慢性疾病，良好的血糖控制可以延遲糖尿病患者神經病性癥狀的出現，但不足以預防或治愈該疾病[6]。多元醇途徑在糖尿病并發癥的發病機制中起重要作用，包括糖尿病白內障、視網膜病變、神經病變和腎病。醛糖還原酶是醛固酮還原酶超家族的一種酶，在葡萄糖代謝的多元醇途徑中催化葡萄糖轉化為山梨醇。在此背景下，醛糖還原酶抑制劑在世界范圍內備受關注[7]。本次研究通過調查醛糖還原酶抑制劑對高糖誘導的單核細胞NLRP3 炎性體的調控，探討其在糖尿病周圍神經病變發生發展過程中潛在的治療作用。

NLRP3 炎性體是迄今為止研究最為充分的炎癥小體，包括NLRP3、ASC和Caspase-1[8]。NLRP3作為炎性體激活的傳感器，可以通過膽固醇晶體、尿酸、微生物和各種其他配體觸發。NLRP3 是炎癥體家族的重要成員，由p10 和p20 亞基組裝而成的活性Caspase-1 異 四 聚 體 可 以 將 無 活 性 的pro-IL-1 β 和pro-IL-18轉化為其生物學活性的分泌形式，從而參與先天免疫應答[9]。本次研究發現與對照組相比，NDPN組 及DPN 組 患 者PBMCs 中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA表達升高，且NLRP3 mRNA表達在DPN 組升高更為明顯。DPN 患者PBMCs中NLRP3、ASC 及Caspase-1 與IL-1β、IL-18 均呈正相關。

IL-1β是先天免疫反應最突出和早期的介質之一，它介導許多炎癥性疾病的發病機制，包括糖尿病和動脈粥樣硬化等[10]。但其在葡萄糖代謝中的生理作用仍然未知，IL-1β的長期上調導致胰島素水平升高，這可能對代謝有害。這可能是因為胰島素通過促進葡萄糖攝取和代謝來增強巨噬細胞的炎癥狀態。IL-18屬于IL-1細胞因子家族，具有主要的促炎作用。研究表明IL-18與肥胖[11]、胰島素抵抗[12]和血脂異常[13]等疾病有關。研究表明血糖調節受損或2型糖尿病患者血清中IL-18水平顯著升高[14]。2型糖尿病患者血清IL-18水平升高與迷走神經活動降低相關[15]。 本次研究也有類似的發現，DPN 及NDPN 組血清IL-1β、IL-18 濃度高于對照組，且NDPN組升高更為明顯。

單核細胞可釋放多種促炎細胞因子，通過自分泌/旁分泌方式引起免疫應答。高血糖是糖尿病患者發生炎癥、細胞凋亡、嚴重的血管舒張、組織損傷和功能障礙的主要因素[16]。醛糖還原酶既是多元醇途徑的關鍵酶，其在高血糖條件下的激活又會導致炎癥反應的發生。本次研究通過體外醛糖還原酶抑制劑及高糖刺激PBMCs，發現與空白組相比，HG組PBMCs中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1mRNA 及IL-18 mRNA 表達升高；與HG 組相比，Fid + HG 組PBMCs 中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1mRNA 及IL-18 mRNA 表達降低。對糖尿病大鼠的研究表明，非達司他可以預防糖尿病大鼠的視網膜氧化應激和VEGF 的過度表達[17]。非達司坦治療糖尿病神經病變大鼠10 周后，背根神經節神經元中山梨醇和果糖水平的增加趨于正常[18]。

綜上所述，DPN 患者血清血清IL-1β、IL-18 濃度升高，PBMCs 中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA表達升高；體外高糖刺激培養DPN患者的PBMCs，發現醛糖還原酶抑制劑可抑制NALP3 炎癥體通路的激活，可能有助于延緩糖尿病周圍神經病變的發生發展。