鼠神經生長因子對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后巢蛋白表達的影響

許鋒，姚文靜，曹春霞，薛媛媛，李玉運，馬立吉，付海波

淄博市中心醫院兒科，山東 淄博 255036

新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxia-ischemia brain damage，HIBD)是圍生期缺氧或窒息后引起的腦神經損傷性疾病。據統計，我國新生兒HIBD發生率為活產兒的0.3%～0.6%，其中15%～20%在新生兒期死亡，存活者中20%～30%可能遺留不同程度的神經系統后遺癥。目前對于新生兒HIBD 治療措施，主要是早期是維持內環境穩定，后期行康復訓練，國內外尚無值得肯定藥物干預措施。鼠神經生長因子(mouse nerve growth factor，mNGF)作為一種具有神經修復功能生物活性蛋白，已廣泛應用于眼科、骨科、神經科等領域。近年來，已有報道mNGF 用于新生兒HIBD 康復治療，治療效果仍不確切。巢蛋白(nestin)作為于神經干細胞(neural stem cells，NSCs)特異性抗原，在受損的神經部位廣泛表達，常作為NSCs 增殖再生研究的標志物。本研究利用新生大鼠HIBD 模型，觀察腦海馬部位nestin 陽性細胞個數變化，以探討mNGF 的神經保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和分組 108 只7 d 齡Wistar 大鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)體質量(15.4±2.2) g，雌雄不限；按完全隨機法原則分為對照組、HIBD組和治療組，每組36只。

1.1.2 主要試劑 兔抗鼠nestin 多克隆抗體(上海科敏生物科技有限公司)；兔IgG 抗體-HRP 多聚體(武漢博士德生物工程有限公司)；注射用mNGF [舒泰神(北京)生物制藥股份有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 新生大鼠HIBD模型制作方法 參照文獻[1]，阻斷左側頸總動脈，術后立即置于缺氧艙(50 cm×60 cm×60 cm，有兩個直徑為3 cm圓孔與外界相通，并放置鈉石灰吸收水和二氧化碳)，8%的氮氧混合氣體低氧暴露2 h。對照組僅暴露游離左側頸總動脈，不做缺氧缺血處理。

1.2.2 干預措施 治療組HIBD后于左側股二頭肌部位肌肉注射mNGF [10 μg/(kg·d)]，連用3 d；對照組、HIBD 組在相同時間點相同部位僅肌肉注射等容積生理鹽水。

1.2.3 標本采集和組織切片的制備 三組大鼠術后4 d、7 d、14 d 用4%多聚甲醛穿心灌注處死后留取腦組織標本，室溫固定24 h，石蠟包埋，在海馬部位連續切片，片厚4 μm，隔4取1，制作免疫組織化學和HE染色切片。以1∶200兔抗鼠nestin多克隆抗體為一抗，行免疫組織化學非生物素二步法及常規HE染色。

1.2.4 數據采集與處理 在Olympus CX33 顯微鏡下，利用計算機細胞圖像分析技術完成圖像采集表及nestin陽性細胞計數。細胞胞漿內會出現棕紅色或褐色顆粒為nestin 陽性細胞。取計數5 個非連續腦組織切片nestin 陽性細胞，以平均值作為該只大鼠陽性細胞計數。

1.3 統計學方法 數據利用SPSS21.0 自動統計分析軟件進行處理，三組不同時點nestin 陽性細胞個數的計量資料均符合正態分布，以均數±標準差(±s)表示。組間兩兩比較采用獨立樣本t 檢驗，三組間比較、同組內不同亞組比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦組織HE染色病理改變 對照組大鼠海馬部位錐體細胞排列整齊、密集；HIBD組大鼠海馬部位錐體細胞排列紊亂，可見單個細胞與周圍的細胞分離，核染色質濃集呈藍色致密的球狀，可見較多凋亡的神經細胞；治療組可見海馬部位錐體細胞層次排列較整齊，胞質濃縮，嗜酸性增強，可見少量凋亡的神經細胞(圖1)。

圖1 三組大鼠術后7 d海馬部位病理改變(HE染色，×400)

2.2 海馬DG區nestin表達 通常nestin染色陽性細胞呈棕紅色或褐色，著色點位于細胞體和突起部分；陰性對照片無相應的nestin免疫反應產物。HIBD組同時點nestin陽性細胞數較對照組增多，差異均有統計學意義(P＜0.05)；治療組同時點nestin陽性細胞數較對照組、HIBD組均增多，差異均有統計學意義(P＜0.05)；nestin陽性細胞數術后7 d達高峰，術后14 d有所降低，各時點比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1和圖2。

圖2 三組大鼠術后7 d海馬部位nestin表達(非生物素二步法，×400)

表1 三組大鼠不同時點海馬DG區nestin陽性細胞數比較(±s，個)

表1 三組大鼠不同時點海馬DG區nestin陽性細胞數比較(±s，個)

?

3 討論

NSCs 存在于中樞神經系統中，具有分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的潛能，在神經損傷修復過程中發揮一定作用。在腦組織內側腦室下區(subventricular zone，SVZ) 及 海 馬 齒 狀 回(dentate gyrus，DG)區是NSCs主要的聚集區域[2]，故作為NSCs的特征性標記物nestin 在SVZ 和DG 區有強表達。本研究以海馬DG區nestin陽性細胞個數作為研究對象，來觀察內源性NSCs的增殖情況。

研究發現新生大鼠HIBD 后腦組織DG 區及SVZ可見少量增殖的NSCs[3]，提示HIBD 本身可促進內源性NSCs 增殖。本研究發現新生Wistar 大鼠HIBD 組DG區nestin陽性細胞個數較對照組各時點均增多，差異有統計學意義，且在術后7 d 達高峰。由此推測HIBD可誘導內源性NSCs的增殖與再生，這與以前研究結果是一致的[4]。

本研究還發現，經mNGF 干預后的新生Wistar 大鼠HIBD模型，在各時點腦組織DG區nestin陽性細胞個數較HIBD組、對照組均明顯增多，且差異有統計學意義。提示mNGF 可能促進內源性NSCs 的增殖再生，在新生大鼠HIBD 后發揮一定的神經修復作用。已知mNGF 是一種分子量為26.5 kD 的生物活性蛋白，是在神經系統生長、分化及功能維持中發揮重要作用的一種細胞因子。mNGF具有維持神經系統正常發育和功能的作用[5]，對神經元有營養支持作用，且能夠促進受損神經組織的修復[6]。研究發現應用mNGF體外誘導臍血間充質干細胞，可以誘導臍血間充質干細胞分化成類神經元和神經膠質細胞[7]。還有研究表明mNGF能誘導NSCs向類神經元分化[8]，對受損神經有修復保護作用[9]。對于mNGF具體的生物學效應機制，目前尚未完全清楚，可能與TrkA 受體[10]和神經營養素受體p75NTR[11-13]有相關性。此外，mNGF也可以通過激活ERK1/2和P13K/Akt通路來促進神經元的分化、存活[14]，對神經元間聯系及損傷后神經元的修復也有生物學效應[15]。目前mNGF 已廣泛應用于眼科、骨科、神經科、兒科等領域，對于腦癱、缺氧缺血性腦損傷、面神經炎、周圍神經損傷等多種疾病的治療，均取得較好療效[16-19]。

總之，本研究已證實mNGF 可促進新生大鼠HIBD 后nestin 表達增加，可能促NSCs 的增殖、分化，為臨床應用mNGF治療新生兒HIBD提供了新的實驗依據。但具體作用機制及增殖后NSCs是否具有生物學功能有待于進一步研究探討。