染發(fā)劑中7 種禁用染料測(cè)定方法的優(yōu)化

彭乃煥,黃忠亮

（百色市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西百色533000）

1 引言

隨著生活品質(zhì)的提高，人們?cè)絹碓阶⒅貍€(gè)人形象，染發(fā)劑作為一種美容美發(fā)方式，成為當(dāng)今社會(huì)的流行時(shí)尚。目前市場(chǎng)上的染發(fā)劑大部分屬于氧化型染發(fā)劑，其主要染發(fā)成分為苯胺類和苯酚類有機(jī)化合物，這些化合物對(duì)人體健康都有不同程度的傷害[1，2]，超標(biāo)超范圍使用是監(jiān)管的重點(diǎn)，我國(guó)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（后簡(jiǎn)稱“規(guī)范”）（2015 年版）[3]中限定了74 種準(zhǔn)用染發(fā)劑，并規(guī)定了對(duì)苯二胺等32 種組分的檢測(cè)方法（后簡(jiǎn)稱“標(biāo)準(zhǔn)方法”），筆者在對(duì)58 批染發(fā)劑按標(biāo)準(zhǔn)方法開展日常檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)：部分樣品在離心處理后溶液渾濁或乳化凝結(jié)，造成過濾困難；部分樣品穩(wěn)定性較差，平行測(cè)定結(jié)果偏差較大。為了完善標(biāo)準(zhǔn)方法，本研究通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[4～7]，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方法中的前處理、色譜條件等進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)優(yōu)化后的方法進(jìn)行方法學(xué)考察，為日常檢驗(yàn)提供參考。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

SHIMADZU LC-20AB 高效液相色譜儀，配備SPD-M10Avp 檢測(cè)器，LC solution 色譜工作站（日本島津公司）；XS205DU 分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；LD5-2A 離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；VXMNAL 渦旋振蕩器（美國(guó)奧豪斯公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品：間苯二胺、鄰氨基苯酚、2-硝基對(duì)苯二胺、甲苯-3.4-二胺、N,N-二乙基甲苯-2.5-二胺鹽酸鹽，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司；鄰苯二胺，德國(guó)j&k 公司；氫醌，北京BePure 公司。甲醇(色譜純，美國(guó)Fesher 公司)，亞硫酸氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、庚烷磺酸鈉、磷酸及乙醇均為分析純。樣品主要來源于2019 年監(jiān)督抽驗(yàn)樣品。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 溶液配制

亞硫酸氫鈉—乙醇混合溶液（下稱：硫醇液）：2g/L 亞硫酸氫鈉溶液∶50%乙醇溶液（1∶1）混合。

磷酸鹽混合溶液：稱取十二水合磷酸氫二鈉1.8g、磷酸二氫鉀2.8g 和庚烷磺酸鈉1.0g，用水溶解并定容至1L，用磷酸溶液（1→10）調(diào)節(jié)pH 至6。

2.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的制備

稱取各染料標(biāo)準(zhǔn)品20mg（精確至0.01mg），分別置10mL 容量瓶中，加入硫醇液溶解并定容至刻度，制成單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。吸取各單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1mL，置10mL 容量瓶中，加硫醇液定容至刻度，制成混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（約0.2mg/mL），置-20℃避光保存。

2.2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量，用硫醇液稀釋，配制成濃度為 5、10、20、40、80μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.2.4 色譜條件

色譜柱：RP-AMIDE C16 色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相 A 為甲醇∶磷酸鹽混合溶液（10∶90），流動(dòng)相 B 為甲醇，梯度洗脫:0～10min，100%A ，10～30min，100%A ～60%A；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：5μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：290nm；柱溫：25℃。

2.2.5 樣品處理

稱取樣品0.3g（精確至0.001g）于塑料離心管中，加入1.0g 硅藻土，玻棒攪拌使膏狀樣品分散于硅藻土上，精密加入硫醇液至20mL，渦旋1min，離心（5000rpm）3min，取上清液經(jīng)微孔濾膜（0.45μm，25mm）過濾，濾液作為供試溶液。

2.2.6 方法檢出限(MDL)評(píng)估

取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量，加入到空白樣品中，按“2.2.5”項(xiàng)下方法，制備濃度為 5、10、20、30、40、50、60μg/g 的檢出限系列供試溶液，按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件，在3d 內(nèi)各濃度水平隨機(jī)測(cè)定10次。以濃度為橫坐標(biāo)，陽性檢出（信噪比≥3）百分率為縱坐標(biāo)，繪制陽性檢出曲線，以拐點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的濃度作為信噪比評(píng)估法的MDL。

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品前處理的優(yōu)化

標(biāo)準(zhǔn)方法中取樣量為0.5g，提取溶液為50%乙醇水溶液，提取溶液體積為10mL。在日常檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：部分樣品提取液乳化或凝結(jié)，難于通過0.45μm 微孔濾膜；部分樣品配方中未見加入亞硫酸氫鈉或異抗壞血酸，制得的供試溶液容易氧化分解，影響測(cè)定結(jié)果。為了消除染發(fā)劑基質(zhì)中增稠劑和凝膠劑的影響，防止供試溶液被氧化，本研究調(diào)整取樣量為0.3g，并加入硅藻土吸附增稠劑和凝膠劑，提取溶液改為硫醇液，提取溶液體積為20mL，調(diào)整后乳化凝結(jié)現(xiàn)象減少，離心后易分層，上清液容易過濾。

3.2 色譜條件優(yōu)化

采用乙腈+磷酸鹽混合溶液（10+90）作為流動(dòng)相時(shí)，3 號(hào)峰與4 號(hào)峰分不開，以甲醇代替乙腈后，兩者分離效果好，但N,N-二乙基甲苯-2.5-二胺鹽出峰時(shí)間太遲，采用梯度洗脫并進(jìn)行預(yù)混合模式，減少基線飄移，優(yōu)化后的方法系統(tǒng)適應(yīng)性良好，見圖1。

圖1 7 種染料的色譜圖

3.3 線性關(guān)系

將混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得到對(duì)應(yīng)的線性方程及相關(guān)系數(shù)，見表1。

表1 各組分線性方程和相關(guān)系數(shù)

3.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在 5、20、80μg/mL 3 個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，取空白樣品，加入混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量，每個(gè)濃度水平平行制備3 份，按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各組分的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果回收率分別為：99.2%，98.2%，99.1%，100.2%，100.1%，97.2%，101.3%，RSD 為：1.8%，2.6%，1.3%，2.5%，3.1%，1.5%，2.2%。

3.5 檢出限與定量限

本方法檢出限為10～40μg/g。定量限以3 倍檢出限確定，即為 30～120μg/g。

3.6 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，分別于配制后0d、7d、14d、21d、30d 時(shí)測(cè)定，結(jié)果各組分的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<5%，表明混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液在-20℃避光保存條件下質(zhì)量穩(wěn)定。

3.7 樣品測(cè)定

選取4 批膏狀氧化型染發(fā)劑的留樣樣品進(jìn)行測(cè)定，并將測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法的結(jié)果相比較，結(jié)果有2 批樣品疑似檢出間苯二胺，經(jīng)與間苯二胺標(biāo)準(zhǔn)光譜圖進(jìn)行相似度檢查，確定不是間苯二胺，4 批測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法的測(cè)定結(jié)果一致。

4 結(jié)語

優(yōu)化后的方法同時(shí)測(cè)定了染發(fā)劑中7 種禁用染料，7 種染料在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù) r 均>0.9999，檢出限為 10～40μg/g，定量限為 30～120μg/g，回收率為 91.7%～106.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.15%～2.61%。優(yōu)化后的方法，樣品前處理簡(jiǎn)單快捷，7 種禁用染料色譜峰分離效果佳，檢測(cè)靈敏度高、準(zhǔn)確性好，適用于染發(fā)劑中7 種禁用染料的定性鑒別和定量檢測(cè)。