基因工程在重組激素生產(chǎn)中的應(yīng)用

（上海市吳淞中學(xué)，上海 200940）

0.引言

近年來，生物技術(shù)在制藥工業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用。應(yīng)用基因工程技術(shù)，可以高效地生產(chǎn)激素、細(xì)胞因子、抗體等重組蛋白。目前，已經(jīng)有超過75種重組蛋白被用作藥物，有360多種基于重組蛋白的新藥物處于臨床試驗(yàn)階段[1]。

重組激素是一類十分重要的重組蛋白藥物。目前，與重組激素生產(chǎn)相關(guān)的基因工程技術(shù)已經(jīng)十分成熟?？茖W(xué)家可以設(shè)計(jì)生物活性更高、半衰期更長(zhǎng)的重組激素。然而，在生產(chǎn)重組激素的過程中，科學(xué)家遇到了一些較為普遍的問題。如何改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)，提高激素的療效，降低激素的生產(chǎn)成本，是一個(gè)十分關(guān)鍵的問題。

1.基因工程

運(yùn)用科學(xué)手段將從某種生物中人工分離特定的DNA片段，將其導(dǎo)入另一種生物中，使生物體的性狀發(fā)生可遺傳改變，這就是基因工程。基因工程在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域都有著十分廣泛的應(yīng)用。

1.1 基因工程的主要工具

科學(xué)家在研究生物大分子的過程中，發(fā)現(xiàn)了大量可以切割、連接DNA雙鏈的酶。應(yīng)用這些酶，可以重組來自不同生物的DNA分子，對(duì)于構(gòu)建符合人類需求的重組細(xì)胞是至關(guān)重要的。此外，科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌體內(nèi)能自主復(fù)制的環(huán)狀DNA分子—質(zhì)?？梢猿蔀榛蚬こ讨械闹匾d體[2]。

1.1.1 工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶可以在特定位點(diǎn)切割DNA分子，在獲取目的基因的過程中，限制性核酸內(nèi)切酶發(fā)揮著重要的作用。目前，人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種限制性核酸內(nèi)切酶。使用能夠連接DNA分子的酶—DNA連接酶，可以將外源DNA與載體相連接。在連接DNA與載體后，篩選連接成功的重組DNA分子。

1.1.2 載體

質(zhì)粒是最常見的載體。質(zhì)粒載體通常帶有一個(gè)或一個(gè)以上的選擇性標(biāo)記基因（如抗生素抗性基因）和一個(gè)人工合成的含有多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作[3]。

1.2 應(yīng)用基因工程生產(chǎn)重組蛋白

在應(yīng)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組蛋白的過程中，科學(xué)家需要從細(xì)胞中獲得的待克隆的DNA鏈（目的基因），將其與質(zhì)粒連接在一起，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌或其他受體細(xì)胞，使基因在受體細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，從而合成大量所需蛋白質(zhì)。為了成功表達(dá)重組基因并產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)，科學(xué)家可能需要改造編碼蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA序列，然后加上控制啟動(dòng)、終止轉(zhuǎn)錄過程的其他序列[5]。

2.基因工程在重組激素生產(chǎn)中的應(yīng)用

2.1 重組人類生長(zhǎng)激素

應(yīng)用基因工程技術(shù)，可以高效地生產(chǎn)重組人生長(zhǎng)激素（rhGH）。1979年，Goeddel等人成功利用大腸桿菌表達(dá)出人類生長(zhǎng)激素（hGH）。目前，Somatrem（一種基因重組生長(zhǎng)激素）已獲得FDA的批準(zhǔn)，用于治療多種人類疾病。據(jù)估計(jì)，每周約有4000～5000名兒童接受這種激素的治療。Somatonorm的結(jié)構(gòu)與垂體產(chǎn)生的天然hGH十分相似，其生理活性較高。許多臨床研究表明，兩種hGH制劑的生物學(xué)作用幾乎完全相同。多項(xiàng)藥理學(xué)和毒理學(xué)研究表明，Somatonorm幾乎不會(huì)引起人體的不良反應(yīng)[6]。

2.1.1 rhGH的生產(chǎn)

在生產(chǎn)人類生長(zhǎng)激素的過程中應(yīng)用的目的基因部分是通過人工合成產(chǎn)生的，部分是通過人類垂體細(xì)胞的mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的?？茖W(xué)家通過人工合成方法，獲得編碼前23個(gè)氨基酸的核苷酸序列，這部分序列來自hGH的已知氨基酸序列，含有翻譯起始密碼子；將垂體mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，可以得到編碼第24-191個(gè)氨基酸的核苷酸序列。將核苷酸序列的兩個(gè)部分融合，并將其插入到表達(dá)質(zhì)粒phGH407中，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12RV308，向孵育培養(yǎng)基中添加四環(huán)素，可以篩選出轉(zhuǎn)化成功的重組細(xì)菌，因?yàn)橹挥泻|(zhì)粒的生物可以在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中存活。進(jìn)行常規(guī)發(fā)酵后，將細(xì)胞與培養(yǎng)液分離并勻漿以破壞細(xì)胞壁，離心去除細(xì)胞壁和碎片后，剩余的裂解物中含有大量的hGH，不過，還需要裂解物進(jìn)行純化，才能得到高純度的hGH[7]。

2.1.2 rhGH的純化

在生產(chǎn)rhGH的過程中，去除裂解物中的大腸桿菌多肽（ECP）是非常重要的。不同的蛋白質(zhì)的分子量和所帶電荷不同，離子交換色譜可以分離帶有不同電荷的蛋白質(zhì)，凝膠過濾可以分離分子量不同的蛋白質(zhì)。因此，可以應(yīng)用離子交換色譜和凝膠過濾等常規(guī)色譜方法，有效去除裂解物中的ECP，提高rhGH的純度，降低不良反應(yīng)發(fā)生率。獲得rhGH純化產(chǎn)物后，進(jìn)行無菌過濾，將終產(chǎn)物放入玻璃小瓶中并凍干，即可得到rhGH成品。

載體質(zhì)粒和宿主細(xì)胞的穩(wěn)定性和完整性是生產(chǎn)rhGH的發(fā)酵過程中關(guān)鍵指標(biāo)。核酸實(shí)驗(yàn)表明，在細(xì)胞復(fù)制25代后，轉(zhuǎn)入基因仍然是非常穩(wěn)定的?？茖W(xué)家還測(cè)試了細(xì)胞對(duì)四環(huán)素、鏈霉素的抗性以及發(fā)酵半乳糖的能力，評(píng)估大腸桿菌細(xì)胞的基因組穩(wěn)定性。多數(shù)研究表明，載體質(zhì)粒和宿主細(xì)胞在整個(gè)發(fā)酵過程中都是較為穩(wěn)定的[8]。

2.2 人重組卵泡刺激素（rhFSH）

2.2.1 促卵泡激素的簡(jiǎn)介

促卵泡激素（FSH）是垂體分泌的一種復(fù)雜的異二聚體糖蛋白，與男性和女性性腺中生殖細(xì)胞的發(fā)育密切相關(guān)。人類FSH藥物制劑在治療人類不孕不育中發(fā)揮著重要的作用。FSH可以刺激卵泡發(fā)育，促進(jìn)婦女排卵，增加受孕的可能性。如今，F(xiàn)SH已經(jīng)成為刺激體內(nèi)多卵泡發(fā)育的常規(guī)治療方法，在得到成熟的卵細(xì)胞后，可以通過體外受精（IVF）和胚胎移植等輔助生殖技術(shù)，獲得將生理活性高的胚胎并將其移植到婦女體內(nèi)，提高懷孕的幾率。在男性體內(nèi)，F(xiàn)SH可以與人絨毛膜促性腺激素（HCG）結(jié)合，促進(jìn)精子生成。因此，F(xiàn)SH還可以用于治療與性腺功能減退相關(guān)的不育癥[9]。

最初，科學(xué)家從垂體中提取可以用于臨床的人FSH，事實(shí)上，這是20世紀(jì)60年代治療與排卵相關(guān)的不孕癥的主要方法。此后不久，一些研究人員發(fā)現(xiàn)，從絕經(jīng)婦女尿液中提取的FSH也是有效的，這種方法降低了FSH生產(chǎn)成本。然而，人體體液中的FSH含量較低，提取步驟較多，工藝十分復(fù)雜，應(yīng)用這種方法生產(chǎn)的FSH不能滿足臨床需求。研發(fā)安全和療效更高的新型FSH治療劑，成為了科研人員面臨的主要問題之一。

2.2.2 天然FSH的特征

天然的FSH是一種糖蛋白，包含兩種不同的亞基（α亞基和β亞基）。基因工程生產(chǎn)的不同亞基，經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)糖基化加工后，以特定的形式結(jié)合為異二聚體，并進(jìn)行翻譯后修飾。等電聚焦分析和色譜聚焦分析表明，從垂體、血清或尿液中分離出的人FSH的性質(zhì)不同。這些同工型FSH帶有不同的電荷，它們的受體結(jié)合能力和體內(nèi)半衰期也有一定的差異，這種差異可能與天冬酰胺連接的寡糖類型相關(guān)[10]。

2.2.3 應(yīng)用基因工程生產(chǎn)rhFSH

應(yīng)用基因工程技術(shù)，科學(xué)家可以改造哺乳動(dòng)物細(xì)胞，從而高效地生產(chǎn)用于臨床治療的人FSH。在應(yīng)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組人FSH時(shí)，選擇合適的工程細(xì)胞是非常重要的，原核細(xì)胞無法形成二硫鍵，不能對(duì)肽鏈進(jìn)行復(fù)雜的翻譯后修飾，因此，科學(xué)家通常用真核細(xì)胞生產(chǎn)FSH。中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞是廣泛使用的生產(chǎn)FSH的工程細(xì)胞，它能夠?qū)﹄逆溸M(jìn)行翻譯后修飾，合成生物活性較高的rhFSH?？茖W(xué)家通常將人FSH基因?qū)隒HO細(xì)胞，使其高效地表達(dá)人FSH，并應(yīng)用先進(jìn)的蛋白質(zhì)純化工藝（免疫親和純化或高效液相色譜）對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行純化，提取能夠用于臨床治療的高純度rhFSH[11]。

在應(yīng)用基因工程生產(chǎn)rhFSH的過程中，科學(xué)家遇到了一些問題，F(xiàn)SH的結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，它的亞單位內(nèi)富含由二硫鍵和與天冬酰胺連接的寡糖鏈，這些特殊的結(jié)構(gòu)對(duì)維持激素的生物學(xué)活性是至關(guān)重要的。在生產(chǎn)過程中，還原劑可能會(huì)破壞二硫鍵，降低FSH制劑的活性。在體外實(shí)驗(yàn)中，缺乏糖鏈的rhFSH不具有信號(hào)傳導(dǎo)功能，而體內(nèi)唾液酸化作用則可能導(dǎo)致rhFSH末端半乳糖部分的暴露，降低其體內(nèi)活性。因此，在生產(chǎn)rhFSH的過程中，必須保持所有翻譯后修飾的完整性。必須選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為工程細(xì)胞，才能保證產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)的完整性。此外，在導(dǎo)入基因時(shí)，科學(xué)家一般將編碼3個(gè)亞基的FSH基因分別導(dǎo)入工程細(xì)胞，并在這些序列前面插入不同的基因元件，從而確保這些基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠形成結(jié)構(gòu)完整的rhFSH[12]。

3.重組激素生產(chǎn)中的典型問題

3.1 表達(dá)下降

大規(guī)模生產(chǎn)重組激素的必要條件是目的基因的有效表達(dá)。但是，由于在進(jìn)行基因重組的過程中，目的基因的結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生變化，在進(jìn)入新細(xì)胞后，目的基因的表達(dá)量可能會(huì)逐漸下降。這可能與所選的質(zhì)粒或病毒的種類和基因整合位點(diǎn)有關(guān)。

3.2 翻譯后修飾

許多天然激素的結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，它們含有大量的二硫鍵和糖鏈，這些結(jié)構(gòu)有助于維持激素的生物學(xué)活性。在生產(chǎn)重組蛋白的過程中，一些新生多肽鏈不能在工程細(xì)胞中構(gòu)成正確的空間結(jié)構(gòu)，甚至形成天然不溶性折疊中間體，這可能影響產(chǎn)物的療效，提高重組激素的生產(chǎn)成本。此外，一些用細(xì)菌細(xì)胞生產(chǎn)的新生多肽鏈缺乏糖鏈修飾，這可能重組激素?zé)o法與細(xì)胞上的受體結(jié)合，影響其療效。

許多科學(xué)家致力于解決重組激素生產(chǎn)中的問題。他們發(fā)現(xiàn)，正確選擇基因載體、在目的基因的上游插入合適的元件，對(duì)維持目的蛋白的表達(dá)水平十分重要[13]。此外，應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的激素大多具有與天然激素相似的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性，然而，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)成本較高，如何改進(jìn)生產(chǎn)技術(shù)，平衡產(chǎn)品質(zhì)量與生產(chǎn)成本問題，是將基因工程廣泛應(yīng)用于合成藥物生產(chǎn)所面臨的重要挑戰(zhàn)。

4.結(jié)語與展望

基因工程在制藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。目前，重組激素的制備技術(shù)已經(jīng)非常成熟，科學(xué)家應(yīng)用多種基因表達(dá)系統(tǒng)，成功地生產(chǎn)了數(shù)百種重組激素。應(yīng)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組激素，可以大大提高產(chǎn)物的純度，擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，降低生產(chǎn)成本。此外，適當(dāng)改造編碼激素的基因，可以延長(zhǎng)激素在體內(nèi)的半衰期，降低不良反應(yīng)的發(fā)生率。目前，已經(jīng)有數(shù)百種重組激素處于臨床試驗(yàn)階段?？梢哉f，重組激素有著極高的商業(yè)價(jià)值，重組激素將成為需求增長(zhǎng)最快的重組蛋白藥物之一[14]。研發(fā)人員應(yīng)當(dāng)深入研究重要工程菌性狀表現(xiàn)的機(jī)制，以及影響基因表達(dá)調(diào)控的因素，不斷改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)，提高產(chǎn)物的生物活性和穩(wěn)定性，降低激素的生產(chǎn)成本。制藥公司需要在重組激素研發(fā)方面投入更多的資金，助力激素產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。