淺析CRISPR-Cas9技術及其應用

（河南師范大學附屬中學，河南新鄉 453002）

0.引言

隨著現代生物學的發展，人們對基因的研究進一步深入。基因編輯就是一種新型的能對基因組進行編輯的技術。目前對基因編輯的研究已經有了一定進展，可以對想要編輯的基因進行較為準確的定點編輯。

核酸酶經基因工程改造后可用于基因編輯，作用主要是在目標基因位點進行剪切，從而導致基因斷裂，生物體可通過自身的修復機制修復斷裂，在修復過程中可能會出錯，將錯誤的基因整合連接起來，而導致靶向突變，我們稱其為基因編輯。高效率是基因編輯技術的重要優勢之一，因此未來如果能將基因編輯技術準確靈活運用于醫療和抵御治療疾病，將會帶來很大的便利，進一步推動現代生物學的發展。

1.技術方法

基因編輯的方法隨著科技的進步而不斷變化，最開始是通過同源重組改變編輯基因，即將想要改變的DNA片段分離，再整合入目標細胞中，這些外來的DNA片段通過直接注射或化學物質促進的方法被細胞所吸收，進一步與原有DNA結合，重組到目標位置。同源重組方法的發現是基因編輯技術研究的一大進步，但這種方法具有不夠準確的缺點，并且效率很低，目前已經不再使用。

在特定位點產生斷裂后才能進行基因編輯，關鍵在于“切割”和“特定”。限制酶是當前實驗和研究中常用的用來切割DNA的工具，它可以有效地斷裂DNA，但在確定切割位置的方面還不夠準確，容易出錯。因此，人們針對這一缺點用生物工程改造了四種核酸酶，研發出了特異性更好的“DNA剪刀”。

巨型核酸酶特點如其名，識別范圍非常大，正是因為它可以單次識別12～40個堿基對的序列，因此它的特異性更強，同時也更加準確。即使在非常復雜的基因組中，我們也可以利用鋅指核酸酶做到準確定位和切割，較為準確，如果在設計鋅指結構域時多加注意，這種方法可以作到對高等生物甚至于人的基因進行準確的編輯。CRISPR/Cas9技術是一種非常有效的基因編輯的方法，通過這種方法使生物具有對外來物質的抵擋能力，多用于治療預防疾病，應用非常廣泛[1]。

2.在腫瘤免疫治療中的應用

早在20世紀，隨著對免疫學研究的深入，研究者們就提出了通過適當改變自身免疫系統的功能來控制并殺死腫瘤細胞的想法，稱為腫瘤免疫療法。20世紀80年代左右，研究者們開始尋找治療腫瘤的方法，他們將滅活的不同菌種的過濾物混合體外培養，嘗試抑制腫瘤細胞的擴散和殺死腫瘤細胞，并取得了成功。在1950年左右，研究者又提出了新的理論，即“腫瘤的免疫監視理論”，認為自身免疫系統可以識別并殺死體內出現異常的腫瘤細胞，這一理論給后人利用免疫系統治療腫瘤疾病提供了很大的啟發。在當代，對腫瘤疾病的研究日益推進，腫瘤免疫治療在治療多種臨床疾病方面都取得了不錯的成效。而隨著對CRISPR /Cas9基因編輯技術的研究深入，研究者們對腫瘤疾病的治療找到了新的思路。

科學家們通過研究古生菌，從而發現了CRISPR/Cas9，即基因編輯系統。它可以對目標位置的RNA進行準確的編輯，是一種獲得性免疫系統。像經基因工程改造后的核酸酶一樣，CRISPR/Cas9也具有在特定位點切割和連接的作用,其作用原理是利用向導RNA結合Cas9蛋白并將其結合體引至PAM識別位點DNA靶標位置上，進一步進行切割誘導產生DSB（Double-Strand Break）,通俗講即目標DNA雙鏈斷裂。在機體察覺到斷裂后，真核細胞就會利用自身的DSP修復功能修補斷裂，這一步驟就是基因編輯進行的關鍵，研究者需要利用DSP修復中相比同源重組更容易出錯的一種途徑來完成滅活靶基因的目的。出錯的原因常表現為以下兩種，一是直接的錯誤修復連接；二是突變產生堿基漏插，一旦出現錯誤，機體即敲除滅活靶基因?；蚓庉嫾夹g雖仍存在許多細節上的不足，但與以前的技術相比，已經有了突破性的進步，且目前在無論是在科研還是醫療尤其是腫瘤免疫治療方面都早已投入使用，推動了現代生物學的發展，影響深遠。

2.1 在免疫阻斷療法中的應用

在T細胞治療的過程中，免疫檢查點起到調節免疫的作用，但部分免疫檢查點的不正常表達和變化會阻礙T細胞作用，并且會利于腫瘤細胞逃逸擴散，從而加重腫瘤疾病帶來的惡劣影響和治療難度。隨著對基因層面研究的進一步深入的發展，目前如果能巧妙運用CRISPR /Cas9基因編輯技術，使機體正常發揮免疫調節，更好的修復自身抵抗腫瘤，也可以達到與傳統技術同樣的效果，并且操作更加簡單，表達效果也更迅速。舉個常見的例子，用sgRNA結合引導Cas9蛋白借助基因編輯電穿孔的方法進入原代DNA中，從而達到敲除程序性死亡受體1基因（PD-1）的目的。PD-1基因被敲除后，表達減少，具體表現為不再對T細胞免疫抑制，被免疫檢查點影響的T細胞恢復原有的增殖和活性，提高T細胞的免疫功能，使腫瘤免疫治療效果更好。通過阻斷療法得到敲除了程序性死亡受體1基因的細胞，此時免疫負調節物對T細胞作用的阻斷途徑被切斷，CAR-T細胞的反應能力有效提高，腫瘤治療效果增強[2]。

2.2 在過繼性細胞治療中的應用

為了達到殺傷腫瘤細胞這一目的，衍生出了通過導出免疫細胞，在體外被動刺激增活免疫細胞后重新導入人體的腫瘤治療方法。

腫瘤浸潤細胞療法是過繼性免疫治療的一種。近年，技術和設施的革新使研究進程不斷加快，表現出了優良的效果，使得這種基于外源基因修飾的過繼性免疫療法一度成為研究的主要方向。

在進行TCR-T時，由于TCR分子自身的不唯一性，外源和內源鏈隨機配對可能會形成雜合TCR分子，提高患自身免疫性疾病的可能性。因此針對本問題的研究重在控制鏈配對的過程，達到減少雜合分子產生的目的。CRISPR/Cas9基因編輯技術在這里的作用表現為編輯切割內源性基因，使T細胞中只存在外源TCR基因，這種方法可以有效阻止雜合分子的產生和減小對機體的不利影響。

修飾外源基因的另一方法為CAR-T，雖然也可以達到過繼性細胞治療的目的，但存在多重限制，原因在于這個方法本身的原理是將病體的T細胞分離處理再重新回輸，而在此過程中又受到T細胞數量的限制和被機體系統排斥的影響，因此CAR-T雖有能力作到T細胞治療，但在實際的應用中并不常見。早期實驗證明如果將T細胞的內源性TCR基因編輯清除后再作用，就可以得到可以有效避免GVHD發生的通用效應T細胞。構建方法即將TCR-T療法和電轉CRISPR編輯系統的方法相結合，把轉化物質導入健康人體的T細胞中，從而得到具有較強抗腫瘤能力的同種異體通用效應T細胞，這類細胞不單單只具有高效的體內抗腫瘤活性，還可以減弱宿主自身系統和CAR-T細胞之間的相互排斥作用。另外，由于構建通用效應T細胞是針對CAR-T的缺陷而進行研究的，因此它與CAR-T相反，能廣泛運用于臨床治療，推動了基因編輯治療產業化實踐化的發展。

2.3 在抗體靶向療法中的作用

在腫瘤治療中常用的方法還有很多，例如利用腫瘤細胞表面會表達許多特殊抗原這一原理進行治療，這些特殊抗原通常與正?？乖休^大的差異，因此研究者可依據這一差異性將抗原位點看作靶點，進一步被機體自身系統抗體識別，從而消滅腫瘤細胞。

研究者通過CRISPR/Cas9基因編輯技術在已經發生了突變的小鼠胰腺導管腺癌細胞中篩選出對癌細胞的增殖分化過程起重要作用的受體，根據抗體靶向治療的原理，針對這一類受體特異性結合。研究結果表明，經實驗處理過的特殊受體相對應的抗體抑制小鼠胰腺導管腺癌細胞增長的能力得到了顯著的提高。這種特殊的受體稱為Frizzled-5，由實驗可以得到，Frizzled-5在抗體靶向療法中可能可以作為靶點，這一結論為免疫治療藥物的研究提供了很大的啟發。

抗體作用大體都是與抗原進行特異性結合后發揮保護作用，但這些不同的抗體在對系統的激活以及刺激免疫細胞對靶細胞的作用等方面仍存在差異，正是利用這種差異在不同方面腫瘤的不同應用，研究者研發出了在抗體多樣化中占重要環節的，抗體類型轉換，轉換過程大致分為兩步，首先是利用B細胞特異性酶起始，在進行不同lg基因間的類別轉換重組。在轉換重組過程中起著決定性作用的一步就是DNA雙鏈的斷裂。在過去，這種斷裂通常通過B細胞特異性酶來進行啟動，哈佛的研究者們首次利用CRISPR/Cas9作用于小鼠多種細胞，有效的提高了抗體類型轉化的效率，從而實現了首次利用CRISPR/Cas9基因編輯技術進行抗體制備。此后，CRISPR/Cas9基因編輯技術成為高速高效簡便易操作抗體制備的主要途徑，在臨床治療和實驗方面廣泛利用[3]。在腫瘤的抗體靶向治療中，抗原抗體結合片段因其自身的結構較小，進入組織更容易等特點而受到廣泛地運用。

3.在遺傳性疾病中的作用

由于CRISPR/Cas9技術的在基因編輯方面顯著的優越性，一經發現，各領域便開始了利用該技術促進本領域發展的相關研究，在農業方面的作物培植到預防治療調控疾病等方面均已投入使用且得到了了較好的成果。由于CRISPR/Cas9系統為可編程系統，且能夠進行基因組編輯，因此在遺傳性疾病的治療中體現了極大的優勢。近年，研究者們已將CRISPR/Cas9技術運用于癌癥和艾滋病等過去死亡率極高的遺傳病，并且取得了理論實驗的成功，目前將此技術運用于臨床治療的進程也在穩定的開展著，若投入使用成功，則能夠為攻克其他遺傳性疾病提供極大的助力，具有很大的發展前景。

研究者們利用小鼠，通過CRISPR/Cas9技術在體內設計構建并且糾正了血友病B的模型，證明了CRISPR/Cas9技術在血液遺傳性疾病方面臨床治療的可行性。在擁有豐富的理論基礎后，研究者們開始投入實際的臨床使用。他們采取手段誘導iPSCs基因分類分化成為紅細胞，再對轉化出的紅細胞進行檢測，發現其可發揮正常紅細胞的作用，產生功能完善的β－球蛋白，從而可以減輕患者的貧血情況，解決地中海貧血癥所引起的病癥。CRISPR/Cas9技術同樣在另一種血液遺傳性疾病，鐮狀細胞性貧血癥中適用。研究者運用相同的方法，通過CRISPR/Cas9技術改造患病者iPSCs中的HBB基因，基因編輯后，改造修復的iPSCs能夠分化到網織紅細胞階段，同樣能夠表達出與正常細胞功能相同的β－球蛋白[4]。

4.在G6PD缺乏癥方面的應用

G6PD缺乏癥病因為能夠調控G6PD的基因發生了不正常的突變，因為蠶豆可以誘導這種突變的發生，因此G6PD缺乏癥又被稱為蠶豆癥。根據G6PD酶的缺乏程度，能夠發揮的作用及障礙程度，可以將G6PD缺乏癥多種類型，不同等級的缺乏在治療過程中也存在差異。經過去的臨床研究得到，調控G6PD基因的突變絕大部分為單基因突變，具有不定向不可控性，存在很多潛在危險，可導致慢性溶血性貧血，并且很難進行臨床治療。在早期實驗中，研究者用CRISPR/Cas9敲除G6PD基因后，發現G6PD的表達顯著下降，這一結論為運用CRISPR/Cas9基因編輯技術治療G6PD缺乏癥的研究提供了很大的啟發。在此研究的基礎上，研究者又運用基因編輯技術將匹配的sgRNA和Cas9蛋白注射入人胚胎中，進一步證明了CRISPR/Cas9所引起的同源重組可以做到校正調控G6PD的基因發生的突變。

基因編輯研究雖然是一種新興的技術，但至今也已進行了近60年的探索，開發了許多基因編輯技術。這些技術雖然也能做到按照人的主觀意愿改造基因，但與Cas9蛋白相比，還有明顯的不足，如只有Cas9蛋白才能做到對DNA、RNA和蛋白質進行共定位。除此之外，CRISPR/Cas9技術還具有特異性高，出錯率低，人工設計操作較簡便和使用范圍廣等優點，具有很強的發展潛能[5]。

5.結語

由于CRISPR/Cas9技術具有高效、編輯速度快等特點，同時與其他基因編輯技術相比較為準確和易操作，在臨床方面也運用廣泛，為多種疾病的治療提供了助力和極大的推動作用。但不可忽視的是，現代生物對基因的研究仍有不足，任何的科技發展都是一把雙刃劍，如CRISPR /Cas9 基因編輯過程中出現的脫靶現象還沒有得到有效的解決，這使得基因編輯的效率受到了影響。應通過增強Cass9蛋白的專一性及提高sgRNA的穩定性等手段，改變靶標效率，盡量減少脫靶現象的出現；同時在對生物尤其是人類的基因進行改造時，不要一味只追求科技的進步而忽視了倫理問題。綜上，基因編輯技術推動了現代生物學的發展，在疾病治療中發揮了很重要的作用，但仍存在一定的缺陷，對CRISPR/Cas9基因編輯技術的研究仍有很長的路要走。