自擬益智方結合音樂治療對阿爾茨海默病模型小鼠的干預研究*

于向榮 周 勤 苗玉榮

阿爾茨海默病(Alzheimer’s diseases，AD)又稱老年性癡呆，是老年人最常見的神經退行性疾病，以進行性認知功能障礙和記憶損失為主要臨床表現，其特征性病理改變主要有β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成老年斑、神經纖維纏結、炎癥與細胞凋亡異常等[1]。伴隨著全球人口老齡化的進一步加劇，有學者預言：到2050年全球AD患者總數將會突破億人大關[2],中國占據了全球總發(fā)病人數的1/4，一直被視為AD的高發(fā)地區(qū)[3]。AD嚴重影響患者生活質量，并給家庭與社會帶來巨大負擔。臨床上采用中醫(yī)藥及音樂治療AD均取得了一定的成果，但將這2種治療方式結合應用的研究較少。本項目組將臨床實踐中摸索總結的有效方劑結合音樂治療應用于動物實驗，觀察在行為學實驗、腦內生化指標檢測及腦組織病理學方面對AD模型小鼠的干預情況，從而為AD治療提供更為有效的新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料普通級雌性NIH小鼠75只，體質量18～22 g,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK (湘)2016-0002。各組小鼠同室分籠飼養(yǎng)，喂養(yǎng)使用普通鼠飼料，自由飲水。飼養(yǎng)室控制溫度20～25 ℃，濕度40%～60%。自擬益智方包括黃芪、當歸、川芎、絞股藍、遠志、石菖蒲、熟地黃、何首烏等(購買于江西黃慶仁棧華氏大藥房連鎖藥店，臨用前制備成水煎劑，低溫保存?zhèn)溆?；鹽酸多奈哌齊片(重慶植恩藥業(yè)有限公司，國藥準字H20010723，產品批號20171101)；D-半乳糖(上海化學試劑總廠試劑二廠)；亞硝酸鈉為市售分析純；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、乙酰膽堿酯酶(AchE) 測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。Morris水迷宮(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司)，SQP型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)，一次性注射器(湖南平安醫(yī)械科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模及干預方法普通級雌性NIH小鼠適應性飼養(yǎng)1周后,將動物隨機分為5組：對照組、AD模型組(簡稱模型組)、自擬益智方(26 mg·kg-1·d-1)組、自擬益智方結合音樂組(簡稱結合組)及多奈哌齊(0.75 mg·kg-1·d-1)組,每組15只。結合組每天選擇輕快、舒緩類型音樂重復播放1 h，模型組和給藥各組腹腔注射D-半乳糖120 mg·kg-1·d-1(生理氯化鈉溶液配制)和亞硝酸鈉90 mg·kg-1·d-1(雙蒸水配制),連續(xù)60 d,對照組腹腔注射等量的生理氯化鈉溶液。從第47天開始，給藥各組灌胃益智方和多奈哌齊,連續(xù)14 d,對照組和模型組灌胃等量的生理氯化鈉溶液[4]。

1.2.2 Morris水迷宮實驗60 d后各組小鼠進行水迷宮實驗，分為連續(xù)5 d的隱藏平臺獲得實驗和第5天的空間探索實驗兩部分。隱藏平臺獲得實驗時，每天在同一時間訓練小鼠2次，每次使同一只小鼠在不同區(qū)域下水，而不同的小鼠在相同的位置下水，找到平臺，并在上面停留3 s以上者，視為找到平臺，記錄其從入水到找到平臺所用的時間，即逃避潛伏期。60 s內沒有找到平臺的要將其引導到平臺上，停留15 s，按60 s計算逃避潛伏期。每次訓練間隔1 h左右。隱藏平臺實驗結束1 h后立即進行空間探索實驗，把第5區(qū)的平臺去掉，讓小鼠在第2象限入水，檢測在60 s內小鼠在平臺區(qū)出現的頻次。隱藏平臺獲得實驗檢測小鼠學習獲得能力，空間探索實驗檢測小鼠空間記憶能力[5]。

1.2.3 生化指標檢測行為學實驗結束后,每組取10只小鼠禁食12 h,斷頭處死,立即取全腦(嗅腦除外)稱重后置玻璃勻漿器中,加入預冷的生理氯化鈉溶液,制成10%腦組織勻漿，3500 r·min-1離心10 min,取上清置于冰水浴中。小鼠腦組織AchE和SOD活力用比色法測定，蛋白定量采用考馬斯亮藍染色結合比色法，具體操作步驟及計算公式按試劑盒說明。

1.2.4 小鼠腦組織病理切片檢查小鼠用4%多聚甲醛灌注后取腦，全腦浸置于4%多聚甲醛中固定24 h以上,石蠟包埋,行冠狀切片,常規(guī)HE染色,光鏡下觀察腦組織海馬區(qū)。

1.3 統(tǒng)計學方法通過SPSS 17.0軟件進行處理，數據用均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對AD模型小鼠學習記憶能力的影響與對照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期顯著延長，平臺穿越頻次顯著減少(P<0.01)；與模型組比較，干預各組小鼠逃避潛伏期顯著縮短，平臺穿越頻次顯著增多(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組小鼠逃避潛伏期和平臺穿越頻次比較 (只，

2.2 對AD模型小鼠腦組織蛋白含量、AchE、SOD的影響與對照組比較，模型組小鼠腦組織中SOD活性顯著降低(P<0.01)，AchE水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，干預各組小鼠腦組織中SOD活性顯著升高(P<0.01)，AchE水平顯著降低(P<0.01)。干預各組小鼠腦蛋白質含量雖然有增多趨勢，但組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠腦內蛋白含量、AchE、SOD活性比較 (只，

2.3 對AD模型小鼠腦組織病理形態(tài)的影響對照組小鼠大腦皮質分層清楚，神經元結構完整，細胞排列整齊，形態(tài)完整，細胞核清晰，尼氏體分布均勻，神經纖維未見纏結；模型組小鼠大腦皮質神經元排列紊亂，細胞核結構不清，尼氏體變淡，神經纖維纏結明顯，部分區(qū)域見神經元變性、凋亡現象，可見嗜神經現象；干預各組小鼠大腦皮層細胞排列較規(guī)則，部分區(qū)域細胞形態(tài)完整，細胞核清晰，神經纖維纏結不明顯，神經元變性現象少見；特別是結合組小鼠與模型組比較明顯改善，大部分區(qū)域神經元排列整齊，細胞核清晰，尼氏體較均勻豐富，神經纖維無明顯纏結，可見衛(wèi)星現象。見圖1。

圖1 各組小鼠腦組織病理形態(tài)觀察

3 討論

現代醫(yī)學對AD的發(fā)病機制尚不明確，有諸多假說，如膽堿能神經元學說、氧化應激學說等，針對的治療靶點也是多種多樣。海馬區(qū)存在大量的膽堿能神經遞質,與機體學習、記憶有密切聯系, AchE是反映膽堿能系統(tǒng)功能的重要標記，它能把突觸間隙中的Ach降解，使其含量降低。因此，降低AchE活力，從而提升腦內膽堿能系統(tǒng)功能可能是抗衰老和改善學習記憶能力的作用機理之一[6]。Aβ聚集可啟動自由基發(fā)生，產生氧化應激，造成神經細胞損傷,被認為是導致許多神經退行性疾病的重要發(fā)病機制[7]。SOD是生物體內抗氧化防御體系關鍵的組成酶類，是重要的自由基清除劑，抑制過氧化物對神經組織的毒害。本研究結果顯示，自擬益智方結合音樂治療可以提高 D-半乳糖聯合亞硝酸鈉誘導的AD模型小鼠腦組織中SOD活性，同時降低腦內AchE活力。

中醫(yī)將AD歸于“呆病”范疇，其病位在腦，發(fā)病機制多為本虛標實，內因為主。患者年老體衰，臟腑機能衰退，精氣虧損，髓海失充，神機失用；加上氣虛推動無力，津血輸布異常，血瘀痰阻，閉塞清竅[8]。中醫(yī)治療AD的歷史由來已久，有著豐富的經驗，而且中醫(yī)藥復方由于其成分的多樣性，可以作用于多靶點、多途徑經，發(fā)揮協同作用。益智方中的熟地黃、何首烏味甘性微溫，歸肝腎經，質地柔潤，滋陰補血，益精填髓，均為補益肝腎精血的常用要藥。精血同源，脾為后天之本，氣血生化之源，主升清。黃芪味甘性微溫，擅長補脾益氣，補氣生血，升舉清陽，將精微物質上輸頭面清竅。當歸味甘辛性溫，為補血活血要藥，用以補血可使補而不滯，用以活血可使祛邪不傷正。《景岳全書》謂之：“補中有動，行中有補，誠血中之氣藥，亦血中之圣藥也。”黃芪與當歸相配，亦合當歸補血湯之意，精血同源，補血以養(yǎng)精。川芎被稱為“血中氣藥”，味辛性溫，辛香走竄，即能活血又能行氣，性善“上行頭目”，載諸藥上行，直達病所。清代陳士鐸在《辨證錄·呆證門》中指出：“痰積于胸中，盤據于心外，使神明不清，而成呆病矣”。遠志，味苦辛性微溫，辛開苦降，宣泄通達，主入心腎經，既能祛痰利心竅而寧心安神，又能通腎氣而強志不忘。《神農本草經》謂其可以“補不足，除邪氣，利九竅，益智慧，耳目聰明，不忘，強志，倍力。” 石菖蒲，味辛苦性溫，辛開苦燥溫通，芳香走竄，長于開心竅、祛濕濁、醒神志。石菖蒲長于辛散溫通開竅醒神，遠志苦降上逆之痰窒效果更佳，兩藥相配可使氣順而壅滯自開，痰濁消散不蒙清竅，神志可清。《證治準繩》的不忘散、《醫(yī)學心悟》的安神定志丸、《備急千金要方》的開心散等安神益智方劑中都配伍了遠志和石菖蒲。絞股藍味甘苦性寒，歸肺脾腎經，益氣健脾，化痰清熱。此外，方中配伍絞股藍還可以制約方中溫性藥物的溫燥偏頗之性。現代藥理研究顯示,熟地黃、何首烏、黃芪、川芎、遠志、石菖蒲、絞股藍等藥物的活性成分具有很好的抗氧化和神經保護作用，可抑制神經細胞凋亡。熟地黃、何首烏、遠志、石菖蒲、絞股藍等藥物的活性成分還具有增強學習記憶能力，改善認知功能障礙等作用[9-13]。

音樂治療可以使AD患者通過以音樂旋律和詞語信息為媒介的交流刺激，更為廣泛地激活相應神經系統(tǒng)，包括皮質下結構和皮質結構，從而提高AD患者的記憶功能[14-19]。音樂治療還能夠改善AD患者的抑郁、焦慮、失眠、激越等情緒和精神行為癥狀[20-25]。隨著現代醫(yī)學模式的轉變，在治療AD等復雜病癥中將人視為一個有機整體，把有效干預AD的方法有機整合，越來越成為一種趨勢。

本實驗結果顯示，自擬益智方結合音樂治療對 D-半乳糖聯合亞硝酸鈉誘導的AD小鼠有一定神經保護作用，可以改善AD小鼠的學習記憶能力，產生抗 AD的藥理作用。其作用機制可能是通過提高小鼠腦組織中SOD活性，提高機體的抗氧化及自由基的清除能力；同時降低AchE活力，從而提升腦內膽堿能系統(tǒng)功能有關。