KAI1、TCF21及PTEN與非小細胞肺癌淋巴結微轉移關系的研究

姜振杰 夏源壯 何 勇*

（大連市第五人民醫院胸外科，遼寧 大連 116021）

肺癌是最常見的惡性腫瘤，早期肺癌以外科手術治療為主，患者是否伴有微轉移對預后影響明顯。目前常規的病理檢測方法及影像學檢查對隱匿性的、微小的肺癌轉移病灶或亞臨床病灶的檢出率較低[1]。隨著分子生物學的不斷發展，腫瘤標志物的表達變化已經具備評估NSCLC淋巴結微轉移的能力，這對肺癌診療十分重要。KAI1/CD82蛋白存在于上皮細胞膜中，提示其與腫瘤細胞的增殖、黏附力、分化及凋亡有關[2]。TCF21基因（調節正常氣道上皮分化）為抑癌基因之一，非小細胞肺癌腫瘤中TCF21較正常肺組織明顯低表達。但是有關TCF21表達與NSCLC的相關性研究鮮有報道[3]。PTEN基因對乳腺癌等多種腫瘤的發生有影響。但其在NSCLC中的作用相關報道卻很少。有研究[4]顯示，細胞角蛋白（CK）和MUC1是判斷非小細胞肺癌微轉移的有效標志物，同樣有研究顯示淋巴結中CK20mRNA、MUC1mRNA作為標志物診斷可有效判斷其微轉移情況。本研究以CK20mRNA、MUC1mRNA作為參照，探討KAI1、TCF21及PTEN與NSCLC淋巴結微轉移之間的關系，以期為臨床診斷及治療提供幫助與參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2005年1月至2010年12月收治的pN0期NSCLC患者，按5年生存期分為復發組[pN0（+）組]，穩定組[pN0（-）組]。以CK20mRNA、MUC1mRNA為標志物，使用反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測證實隨訪5年復發組中術時存在淋巴結微轉移者22例（39.29%）作為pN0（+）組；篩選34例（60.71%）5年隨訪穩定者作為pN0（-）組。患者中男30例，女26例，年齡41～72歲，平均年齡（52.9±8.90）歲。所有患者均符合國際抗癌聯盟（UICC）肺癌的診斷標準。經大連市第五人民醫院病理中心病理學確認和CK20mRNA、MUC1mRNA檢測。

1.2 主要儀器和試劑 RT-PCR引物（上海吉凱合成），DNA marker、RNA提取及逆轉錄試劑盒、PCR儀（購自Abcam公司），Anti-TCF21 antibody（GeneTex，美國）、Anti-CD82/KAI1antibody（Novus，美國）、Anti-PTEN antibody（Boster，美國）、Cy3標記山羊抗兔IgG（H+L）（Beyotime，中國）。

1.3 標志物 DNA marker，RNA提取及逆轉錄按照試劑盒操作說明進行，PCR擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 免疫組織化學方法 脫蠟前，應該將組織芯片在室溫中放置60 min或60 ℃恒溫箱中烘烤20 min，組織芯片置于二甲苯中浸泡10 min，更換二甲苯后再浸泡10 min，無水乙醇中浸泡5 min，抗原修復：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。高壓熱修復在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，同時將玻片置于金屬染色架上，進行緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5 min，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10 min后，去除熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。按照Allred score評分標準將免疫組化評分基于細胞染色強度評分及陽性細胞比例評分兩部分。按照切片中細胞染色強度計分為0、1、2分。隨機選取10個高倍視野，依照每高倍視野陽性細胞所占比例計算：1.00%～30.00%、31.00%～75.00%、76.00%～100.00%分別為1、2、3分。總評分為二者乘積，積分為0分表示陰性（-），積分為1～4分表示弱陽性（+），積分大于4分表示強陽性（（++）。陽性表達率=（弱陽性例數+強陽性例數）/總例數×100%。

1.5 統計學方法 數據統計采用SPSS20.0統計軟件完成，計量資料用平均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料用（n，%）表示，組間比較采用卡方檢驗，P＜0.05認為差異具有統計學意義。

圖1 免疫組織化學檢測結果（HE×100）

2 結果

2.1 CK20mRNA、MUC1mRNA檢測pN0期NSCLC淋巴結微轉移情況分析 經病理學確認以及CK20mRNA、MUC1mRNA檢測，56例pN0期NSCLC患者中淋巴結微轉移患者22例（39.29%）為pN0（+）組，非淋巴結微轉移患者34例（60.71%）為pN0（-）組。與pN0（-）組相比，pN0（+）組CK20mRNA、MUC1mRNA水平增高。

2.2 KAI1、TCF21、PTEN免疫組化檢測結果 免疫組化結果顯示，pN0（+）組基因表達水平明顯低于pN0（-）組。見圖1。與pN0（-）組患者相比，pN0（+）組患者KAI1、TCF21及PTEN水平明顯降低（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者KAI1、TCF21及PTEN水平比較

3 討論

非小細胞肺癌是一種肺部的惡性腫瘤，是我國常見的腫瘤，癥狀與原發病灶位置以及轉移情況有著密切關系。目前并未有準確評估方法，同時也缺乏有效的評估微轉移的分子標志物。本研究應用CK20mRNA、MUC1mRNA作為標志物，檢測pN0期NSCLC淋巴結微轉移情況，經病理學確認以及CK20mRNA、MUC1mRNA檢測，56例患者中pN0（+）組患者22例（39.29%），pN0（-）組34例（60.71%）。與pN0（-）組相比，pN0（+）組CK20mRNA、MUC1mRNA水平增高。結果趨勢與既往報道相符[5]。本研究分析腫瘤抑癌基因KAI1、TCF21及PTEN與NSCLC患者淋巴結微轉移之間的聯系后發現，與pN0（-）組患者相比，pN0（+）組患者上述3種基因水平均顯著下降，這提示在NSCLC患者中，KAI1、TCF21及PTEN可能與淋巴結微轉移有關。

KAI1基因在多種腫瘤中存在差異性，容易造成患者腫瘤細胞黏附力降低，移動能力逐漸減弱，逐漸演變為惡性淋巴瘤。淋巴結轉移的KAI1蛋白的表達幾乎缺失，并由此推測KAI1可能與結腸癌的轉移密切相關[6]。在本次實驗中，結果顯示，pN0（+）組KAI1蛋白的陽性表達率下降，提示其表達下調可能與NSCLC淋巴結微轉移的發生、發展有關。TCF21基因在腫瘤的侵襲轉移中發揮重要的作用[7]。研究表明[8]，TCF21在黑色素瘤中能夠上調KISS-1基因在蛋白中的表達，從而降低其侵襲能力，其與NSCLC分化程度及淋巴結轉移密切相關。在本研究中，從TCF21的蛋白表達角度判斷，認為TCF21蛋白的表達情況對腫瘤的生物學行為有著重要的作用。pN0（+）組患者TCF21蛋白的陽性表達率顯著下降，提示遠處轉移風險增加、患者預后可能較差。PTEN能夠抑制細胞生長、黏附、轉化及遷移，促進細胞凋亡，對腫瘤生長和轉移起到負向調控作用[9]。子宮內膜癌的PTEN突變率或缺失率高達50.00%～83.00%，此外，在胃癌、甲狀腺髓樣癌中，有關PTEN的研究也顯示其可抑制腫瘤細胞增殖，與腫瘤分期密切相關。但PTEN在NSCLC中的相關研究卻極為有限。本研究結果顯示，在pN0（+）組患者中PTEN蛋白的陽性表達率顯著下降。提示PTEN表達下調可能與非小細胞肺癌淋巴結微轉移的發生、發展有關，這一結果與其他惡性腫瘤相關研究趨勢相符合[10-11]。

綜上所述，本研究從KAI1、TCF21及PTEN的蛋白表達角度分析，認為KAI1、TCF21以及PTEN蛋白的低表達對非小細胞肺癌的生物學行為有著重要的作用，并可能預示肺癌發生微轉移風險增加，影響患者預后，對于早期發現和預防肺癌轉移具有重要理論及臨床意義。但腫瘤的發生及轉移是多因素作用的結果，因此，具體相關機制還有待繼續研究探索。