胃腸道間質瘤胰島素樣生長因子1受體表達水平與伊馬替尼耐藥的相關性

王炯元， 童漢興， 姜 銓， 侯英勇， 陸維祺*

1. 復旦大學附屬中山醫院普通外科，上海 200032 2. 復旦大學附屬中山醫院病理科，上海 200032

胃腸道間質瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)起源于Caja細胞，是消化系統最常見的間葉源性腫瘤，占胃腸道腫瘤總數的1%～4%，每年發病率約為2/10萬[1-2]。GIST可發生在消化系統的任何部位，其中以胃(60%)和小腸(30%)最常見[3-4]。肝轉移和腹腔播散是GIST臨床上最常見的惡性表現，淋巴結轉移少見。c-Kit基因及血小板衍生生長因子受體α(platelet-derived growth factor receptor alpha，PDGFRα)基因的功能獲得性突變是GIST發病的主要機制[5]。75%～80%GIST存在c-Kit基因突變，5%～10%GIST伴PDGFRα基因突變[6]，10%～15%GIST既無PDGFRα基因突變也無c-Kit基因突變，被稱為野生型GIST。一部分野生型GIST患者伴SDH基因改變，被稱為SDH缺陷型，也有極少數病例存在NF-1、BRAF等其他基因的罕見突變[7]。

甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate，IM)是一種選擇性酪氨酸激酶抑制劑，自2002年獲得美國FDA批準以來，已成功應用于治療轉移性和(或)無法切除的GIST患者，同時也用于高危復發風險患者的術后輔助治療。隨著藥物的臨床應用，其耐藥問題也日益彰顯，10%～15%患者存在原發耐藥，40%～50%患者在2年內出現繼發性耐藥[8]。SDH缺陷型GIST患者多表現為原發耐藥。繼發性耐藥的可能機制則包括c-Kit和PDGFRα基因的二次突變、基因擴增、下游信號通路的異常活化、IM血藥濃度及細胞內藥物濃度的改變等[9]。IM耐藥機制尚未被完全闡明，可能是多個機制共同作用的結果。因此，IM耐藥是目前GIST臨床治療的難點，也是當下臨床研究的熱點。

胰島素樣生長因子家族(insulin-like growth factors，IGFs)由胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor 2， IGF-2)、胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)、胰島素受體(insulin receptor，IR)及6個胰島素生長因子結合蛋白(IGF-binding proteins，IGFBPs)組成[10]。IGFs在細胞分化、增殖及個體的生長發育中具有重要的促進作用[11-12]，也與腫瘤形成及發展密切相關。Tarn等[13]報道，野生型GIST中IGF1R的表達高于c-Kit/PDGFRα突變型標本，提示IGF1R可能是原發性耐藥患者的潛在治療靶點。因此，本研究回顧性分析復旦大學附屬中山醫院收治的134例GIST組織IGF1R的表達水平與IM耐藥的關系，探討IGF1R對IM耐藥GIST患者預后的潛在價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2008年1月至2014年1月復旦大學附屬中山醫院普通外科收治的經病理確診的GIST患者的臨床及病理資料。將所有病例術后組織石蠟切片制作組織芯片用于免疫組化染色。患者出院后通過門診及電話隨訪患者生存情況。本研究患者均知情同意且簽署知情同意書。

1.2 免疫組化法檢測組織芯片中IGFR蛋白的表達 IGFR檢測采用免疫組織化學法。組織芯片使用二甲苯脫蠟，梯度乙醇溶液(無水、95%、75%)脫水，TBS沖洗。檸檬酸抗原修復液處理后加入3%雙氧水阻斷其內源性過氧化物酶。沖洗后用10%山羊血清孵育30 min。移去血清，滴加按1∶150稀釋的兔抗人多克隆IGF1R抗體(Abcam公司，美國)4℃孵育。沖洗后滴加生物素標記二抗(EnVision抗兔IgG試劑盒，Dako公司，丹麥)，室溫孵育30 min后移去二抗，滴加新鮮配制的DAB顯色并使用蘇木精對比染色。梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明，封片劑封片后鏡檢。

1.3 免疫組化結果判讀 以染色強度結合陽性細胞數百分比綜合計分，組織切片中胞質染為淡黃色至棕褐色者為陽性細胞。染色強度以多數細胞呈現的染色特性(染色深淺需與背景著色相對比)計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分比即光學顯微鏡下隨機取5個高倍視野(×400)，每個視野中計數100個腫瘤細胞，取陽性細胞平均數：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色結果為染色強度與陽性細胞百分比的乘積：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性()，9～12分為強陽性()。評分<5分為IGF1R低表達，≥5分為IGF1R高表達，以上結果由2位有經驗的病理科醫生完成。

1.4 統計學處理 采用SPSS 24.0分析數據。計數資料采用χ2檢驗，采用Kaplan-Meier繪制生存曲線，生存分析的組間比較采用log-rank檢驗，采用Cox風險比例回歸模型對IM耐藥患者行預后危險因素分析。檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 GIST患者不同臨床病理特征下IGF1R蛋白表達差異 結果(表1)顯示：GIST組織IGF1R蛋白表達水平在不同性別、年齡、腫瘤大小、原發部位、核分裂相、突變基因、NIH危險度分級組間表達差異無統計學意義；IM耐藥患者GIST組織IGF1R蛋白的表達率(73.08%)高于非IM耐藥患者(41.67%)，差異有統計學意義(χ2=8.286，P=0.004)，提示IGF1R高表達可能與GIST患者IM耐藥相關。圖1示GIST標本病理結果。

表1 不同IGF1R蛋白表達水平GIST患者臨床病理特征的對比 n(%)

圖1 GIST組織不同IGF1R蛋白表達水平的免疫組化及H-E染色

2.2 生存分析 中位隨訪64.5(1～96)個月，134例患者中9例患者失訪，27例患者死亡。26例IM耐藥患者中2例失訪，12例死亡。26例IM耐藥患者預后風險的單因素分析結果(表2，圖2)顯示：IGF1R的表達水平與總生存時間相關，IGF1R高表達患者總生存時間短于IGF1R低表達患者(35.3vs71.3個月，P=0.04)。多因素分析結果(表3)表明：腫瘤原發部位、IGF1R表達水平是影響IM耐藥患者總生存時間的獨立危險因素。

表2 IM耐藥GIST患者預后的單因素分析

圖2 不同IGF1R表達IM耐藥GIST患者預后分析

表3 IM耐藥GIST患者預后的多因素分析

3 討 論

IGF1R是一種跨膜受體酪氨酸激酶，可結合其配體IGF-1和IGF-2而被激活，并通過活化下游信號通路，包括磷脂酰肌醇3激酶-蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶(PI3K-Akt)信號通路及絲裂原活化蛋白激酶(MAKP)通路，發揮生物學效應。近年來，IGFs在GIST發生發展中的作用也引起了關注。Tarn等[13]報道相對于c-Kit/PDGFRα突變型GIST，野生型GIST中IGF1R的表達顯著升高，而野生型GIST往往表現為原發性耐藥。而IGF1R是否參與了胃腸道間質瘤IM耐藥目前尚不清楚。

本研究中，在IM耐藥患者GIST組織IGF1R蛋白表達顯著高于非耐藥患者，由此推測IGF1R可能參與IM耐藥的產生。Codony-Servat等[14]研究發現，在轉移性結直腸癌中細胞核IGF1R的高表達可能導致化療及靶向藥物耐藥的產生。近年來多個針對IGF1R的靶向藥物已陸續進入臨床試驗，現有證據表明目前抗IGF1R治療最大的作用在于預防或逆轉傳統治療耐藥。并且相較于單獨應用，抗IGF1R治療聯合化療或靶向治療能增加獲益[15]。Chen等[16]在IM耐藥細胞系(GIST430和GIST48)中使用linstinib(一種IR/IGF1R抑制劑)與IM聯合治療，分別導致IM GIST430和GIST48的生存力降低60%和80%；而在IM敏感的GIST882細胞系中聯合治療與IM單藥的效果相當。因此，IGF1R可作為IM耐藥病例的潛在治療靶點。本研究中，針對26例IM耐藥患者的生存分析提示，IGF1R高表達患者總生存時間顯著縮短，推測在IM耐藥患者中IGF1R可作為預后不良的標志。同時，多項臨床試驗發現，IGF1R高表達的患者能從抗IGF1R治療中獲益。Asmane等[17]發現在使用抗IGF1R治療的肉瘤患者中，IGF1R的核定位增加與良好的生存預后顯著相關，提示IGF1R的表達或可成為篩選患者及監測治療反應的潛在生物學標志物。

綜上所述，本研究發現，IM耐藥患者GIST組織中IGF1R的表達顯著增高，IGF1R高表達患者的總生存時間短于IGF1R低表達患者，提示IGF1R參與GIST IM耐藥的同時，或可作為IM耐藥患者的預后判斷指標，并且可能是IM耐藥患者的潛在治療靶點。