海藻糖對凍存海馬神經元電生理特性的影響

王國祥， 劉 娟， 周志遠， 劉 旭*

1. 復旦大學腦科學研究院，上海 200032 2. 復旦大學附屬中山醫院放療科，上海 200032 3. 復旦大學附屬中山醫院神經內科，上海 200032

海馬作為中樞神經系統的重要組成部分，與學習、記憶、癲癇密切相關[1-3]，是神經生物學研究的熱點。體外培養的海馬神經元是研究神經系統疾病常用的載體，在神經生物學研究中被廣泛應用[4-6]。實驗過程中，海馬神經元需要從胎鼠或乳鼠提取進行原代培養，無法像腫瘤細胞株進行體外傳代培養，因此無論從動物保護、動物倫理，還是盡量減少資源浪費和保存珍稀動物模型細胞樣本的角度出發，神經元凍存后復蘇再利用都顯得尤為重要。

凍存細胞的常規操作是緩慢降溫，最后保存于-80℃冰箱或者液氮中。目前常用的冷凍保護劑有二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇和甘油等。既往研究[7-10]大多對凍存后海馬神經元的形態進行觀察，而未檢測其電生理功能，僅Quasthoff等[11]利用多電極微陣列(MEA)進行了皮層神經元凍存后整體神經元放電情況觀察。海藻糖是一種非滲透性保護劑，由2個葡萄糖分子構成，能穩定生物膜和蛋白質結構，使生物體免受氧化應激的損傷，可應用于多種細胞和器官凍存中[12-14]。本實驗采用無血清凍存液、DF12+10% DMSO凍存液、DF12+10% DMSO+海藻糖凍存液凍存細胞，評估其對海馬神經元凍存復蘇后電活動的影響，為建立穩定的原代海馬神經元保存技術提供基礎。

1 材料與方法

1.1 原代海馬神經元分離與混合培養 采用石瑩等[15]的方法：孕18～19 d SD大鼠，經烏拉坦深度麻醉后，剖腹取胎鼠5～6只，快速去除頭皮及顱骨，取出完整的腦組織，分離海馬并去除血管。用預熱好的0.25%胰蛋白酶消化10～15 min，期間搖勻2～3次，用含10% 磷酸鹽緩沖液(FBS)的DF12培養基終止消化，用經火焰拋光的玻璃滴管吹打20次左右，直到無明顯的組織塊。離心收集細胞，接種于預先用貼壁因子多聚賴氨酸(PDL)包被過的24孔板中。培養后每隔3 d更換NB27培養基(每次均為半換液)。第14～17天進行膜片鉗檢測。

1.2 海馬神經元冷凍保存及復蘇 海馬神經元培養當天，分別用無血清凍存液(無血清組)、DF12+10% DMSO(DF12+DMSO組)、DF12+10% DMSO+0.1 mol/L海藻糖(DF12+DMSO+海藻糖組)凍存。

7 d后取出凍存的海馬神經元，快速放入37℃水浴箱中解凍，然后以1 000r/min離心5 min，除去凍存液，對收集得到的海馬神經元計數、接種。凍存成活率定義為復蘇當日計數的海馬神經元與原代分離的海馬神經元數目之比。

1.3 神經元電生理記錄 玻璃電極經拉制后，電阻為3～5 MΩ，當電極尖端與神經元形成GO封接后，負壓吸破細胞，隨后進行全細胞模式下電壓鉗或者電流鉗記錄。采集電流經放大器Axonpatch 700B放大，由Digital 1440A采集后儲存。記錄動作電位時，細胞外液含NaCl 128 mmol/L、葡萄糖 30 mmol/L、Hepes 25 mmol/L、KCl 5 mmol/L、CaCl22 mmol/L、MgCl21 mmol/L，pH為7.3；細胞內液含K-gluconate 125 mmol/L、KCl 10 mmol/L、乙二醇雙四乙酸(EGTA)5 mmol/L、Hepes 10 mmol/L、Tris-磷酸肌酸 10 mmol/L、MgATP 4 mmol/L、 NaGTP 0.5 mmol/L, pH為7.3。記錄微抑制性突觸后電流(mIPSC)時，在上述記錄動作電位的細胞外液中添加河豚毒素(TTX，1 μmol/L)、2-氨基-5-膦酰戊酸(APV，25 μmol/L)、二硝基喹酮(DNQX，20 μmol/L)，細胞內液含CsCl 140 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、Hepes 5 mmol/L、CaCl22 mmol/L、MgATP 2 mmol/L、NaGTP 0.3 mmol/L、QX-314 5 mmol/L。記錄微小興奮性突觸后電流(mEPSC)時，在上述記錄動作電位的細胞外液中添加TTX 1 μmol/L、Bicuculline 20 μmol/L；內液與上述記錄動作電位內液相同。

1.4 觀察指標 觀察原代神經元及凍存神經元復蘇培養后形態、成活率、動作電位。Burst樣放電神經元定義：持續去極化超過10 mV，在整個去極化放電過程中有連續不少于5個動作電位發放，定義為1次Burst樣放電，10 min內有2次及以上Burst樣放電則定義該神經元為Burst樣放電神經元[16]。mIPSC與整個神經網絡中抑制性神經遞質γ-氨基丁酸(GABA)的釋放量、抑制性突觸數目和GABA受體相關[17-18]；mEPSC與興奮性神經遞質谷氨酸的釋放量、興奮性突觸數目和受體相關[19-20]。

2 結 果

2.1 細胞形態學 培養成熟的原代未凍存神經元胞體飽滿，細胞周圍有光暈，經MAP2染色發現樹突光滑無間斷點(圖1)；接種2 h后可觀察到細胞貼壁；接種24 h后，神經元伸出較長的軸突，其中星形膠質細胞伸出片狀偽足進行貼壁生長。無血清組和DF12+DMSO組復蘇后，神經元的樹突和軸突生長緩慢，而經DF12+DMSO+海藻糖組復蘇后的神經元生長情況與原代未凍存海馬神經元接近(圖2)。

2.2 海馬神經元成活率 海馬神經元采用不同的凍存液凍存7 d后復蘇，測定其成活率。計數發現，添加海藻糖的DF12+DMSO+海藻糖組成活率最高，且與無血清組有較大差異(P<0.01，圖3)。

圖1 原代未凍存海馬神經元體外培養形態

圖2 海馬神經元體外培養24 h軸突生長情況

圖3 不同凍存液凍存7 d后細胞存活率

2.3 動作電位發放 神經元經膜片鉗記錄顯示，原代未凍存海馬神經元中有Burst樣放電的神經元約占20%。無血清組和DF12+DMSO組神經元中Burst樣放電神經元占比升高(P<0.05)，DF12+DMSO組神經元中Burst樣放電內動作電位頻率顯著升高(P<0.001)；而DF12+DMSO+海藻糖組神經元中Burst樣放電神經元占比與原代未凍存海馬神經元接近(圖4)。

圖4 未凍存和經凍存后的海馬神經元動作電位發放比較

2.4 mEPSC和mIPSC 與原代未凍存海馬神經元相比，經3種不同凍存液凍存過的神經元mEPSC幅度變化均較小，頻率略升高，但差異無統計學意義(圖5)。與原代海馬神經元相比，無血清組和DF12+DMSO組神經元的mIPSC幅度顯著下降(P<0.001)，DF12+DMSO組神經元的頻率顯著下降(P<0.01)；而DF12+DMSO+海藻糖組神經元的mIPSC幅度和頻率均無明顯變化(圖6)。

3 討 論

DMSO是常用的凍存保護劑，但是DF12+(10%～20%)DMSO凍存后的海馬神經元的電生理特性是否改變，目前鮮見探索。神經元培養的特點是形成神經網絡和電活動。本研究顯示，體外分離培養的原代海馬神經元具有典型的“三角形”椎體神經元形態，表面光滑、輪廓清晰，Burst樣放電的神經元比例低。

圖5 原代未凍存和經凍存后的海馬神經元mEPSC比較

圖6 原代未凍存和經凍存后的海馬神經元mIPSC比較

目前，海藻糖對低溫保存細胞，例如胰島、皮膚、臍帶血、腎細胞等均表現出較好的保護效果[21-24]。并且，海藻糖在器官(如氣管、肺臟等)的保存中取得了滿意的臨床效果[25-27]。

第1次凍存神經元是在1953年，由Luyet和Gonzales[28]完成。Paynter[29]對于各種神經元的凍存方法進行過總結。Fortin等[30]將凍存后的神經干細胞誘導成神經元樣細胞后進行動物活體移植，發現與未凍存細胞效果無明顯差異。有研究[31]將凍存后的內側神經節隆起(MGE)核團的神經元凍存后移植到動物體內，發現其能形成神經網絡，且與正常GABA能神經元形態接近。但上述研究僅關注了神經元的形態和復蘇存活率，而忽視了神經元的電生理特性改變的可能。Seggio等[10]凍存大鼠脊髓背根神經節(DRG)神經元后發現，凍存后的DRG神經元的軸突生長速度與原代培養的DRG神經元接近。本研究也發現，利用無血清凍存液和DF12+10%DMSO凍存后，海馬神經元的軸突生長速度減慢，而利用含海藻糖的凍存液凍存后軸突生長速度與原代神經元類似。有研究[11]用MEA記錄發現，皮層神經元經凍存后整體放電頻率與原代培養的皮層神經元類似。本研究發現，用DF12+10%DMSO或凍存腫瘤細胞株常用的無血清凍存液凍存神經元后，單個神經元的放電特點和神經元網絡均改變，與原代未凍存海馬神經元的放電特點有較大差異。已有文獻[32-33]表明，0.1 mol/L的海藻糖在動物精子的凍存中對其具有保護作用。本研究發現，添加0.1 mol/L海藻糖的凍存液凍存海馬神經元后，神經元的電生理特性與原代未凍存神經元類似，可能是由于海藻糖能使抑制性神經元的數目減少，或對神經元細胞膜表面的GABA受體起保護作用，從而未誘導Burst樣放電產生。同時，本研究中DF12+DMSO+海藻糖組成活率也提高，神經元細胞形態與原代未凍存海馬神經元類似。

DMSO保護細胞的機制可能是其與水形成氫鍵改變了水變成冰的速度，同時進入細胞內減少細胞脫水，使細胞免受高濃度鹽離子損傷。海藻糖不能穿透細胞膜進入細胞內，其保護海馬神經元的具體機制尚不明確[34]，目前主要有2種假說。(1)水替代假說：海藻糖在細胞脫水時取代水分子與細胞膜的磷脂雙分子層和膜蛋白結合保護其天然結構[35]；(2)玻璃態假說：海藻糖與鄰近分子在-30℃左右形成玻璃態，該溫度遠高于DMSO形成玻璃態所需溫度，玻璃態擴散系數低，可以使生物大分子維持比較穩定的空間結構[36]。另有研究[37]表明，海藻糖可以抑制炎癥、氧化應激反應；且星形膠質細胞可以產生內源性海藻糖供神經元利用，促進神經元樹突生長[38]。海藻糖保護神經元可能是多種機制共同作用的結果，從神經元功能、網絡和成活率角度講，建議在凍存海馬神經元時凍存液中添加海藻糖。

綜上所述，本研究采用含海藻糖的凍存液凍存原代海馬神經元后，神經元的電生理特性優于不含海藻糖的凍存液凍存的海馬神經元。本研究為提高原代海馬神經元的利用率、保存珍貴海馬神經元標本奠定了基礎。