馬尾松林下種植五指毛桃的生長評價

陳英之，李良波，甘鳳瓊，黃榮韶

（1. 廣西大學農學院，廣西 南寧 530004 ；2. 廣西中醫藥大學藥學院，廣西 南寧 530200）

林藥種植是根據林下不同環境條件，將適宜林下生長的藥用植物重新引種到林下進行半野生化栽培[1]。五指毛桃為桑科榕屬植物粗葉榕（Ficus hirtaVahl），入藥部分為其地下根莖，是地道的民族藥材，被《中華人民共和國藥典》1977 版收載[2]。補骨脂素為五指毛桃質量評價的主要指標成分[4-6]，佛手柑內酯為次要指標成分[8]。補骨脂素具有抗血凝、擴張冠狀動脈、降壓、止咳、抑制腫瘤、防御紫外線損傷、免疫調節等作用[8-9]。五指毛桃具有健脾補肺、舒筋化濕之功效，對脾虛浮腫、盜汗、肺癆咳嗽、風濕痹痛、肝硬化腹水、慢性支氣管炎和產后無乳等癥有特殊療效[2-3]。目前,五指毛桃人工種植比較少，藥材來源主要依靠野生資源。近年來，隨著五指毛桃需求量的增加，市場供不應求，致使五指毛桃遭到掠奪式的采挖，野生資源日漸枯竭，給環境和資源造成巨大壓力。馬尾松（Pinus massoniana）是廣西分布面積最大的造林樹種，面積達231.6 萬hm2。成齡的馬尾松樹林具有一定的蔭蔽度，適合耐陰植物生長。五指毛桃為小喬木，多生于海拔500 ～1 000 m 的灌叢山谷、林緣、疏林或村寨附近濕潤溫暖之地[10]。五指毛桃具有一定的耐陰性，從生態角度來看五指毛桃適合在成齡馬尾松林生長。

林藥種植充分利用林地資源，多層次立體結構能夠提高光能利用率和空間利用率，同時還能提高土壤肥力，改良土壤理化性質，改善生態環境，達到良性循環[11-12]。倪樂[13]研究了不同樹種套種模式對雷公藤甲素含量動態變化、林地土壤養分變化等，認為厚樸林下套種雷公藤模式可以增加雷公藤根和葉中的雷公藤甲素含量，厚樸林下套種雷公藤可以提高林地土壤的全氮含量。李娟等[14]在橡膠林下間作五指毛桃，科學合理施肥，既有利于五指毛桃的生長發育，又有利于橡膠樹膠乳產量的增加。目前，關于林下種植五指毛桃的研究比較少，馬尾松林下種植五指毛桃的研究尚未見報道。筆者對馬尾松林下不同生長年限五指毛桃的生長表現進行綜合評價，并對不同年份的五指毛桃主要活性成分含量進行分析，為馬尾松林下規模化種植五指毛桃的最佳采收時期提供指導。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地安排在南寧市邕寧區那樓鎮廣澤健康產業種植基地，屬天然馬尾松林地，地處亞熱帶季風區，東經108°35'，北緯22°38'，海拔高度不足100 m，日照充足，雨量充沛，年平均氣溫21.8℃，年平均降水量1 472.1 mm，無霜期長，雨季多集中于4—9 月。試驗地屬于丘陵山地，山體坡度約為25°，土壤以紅壤為主，土層深厚，肥沃, 腐殖質含量較豐富。

1.2 試驗材料

1.2.1 供試種苗供試種苗購置于廣西靈山縣伯勞鎮遠豐苗木基地，經廣西中醫藥大學黃榮韶教授鑒定，確認為五指毛桃（Ficus hirtaVahl）。

1.2.2 儀器及設備e2695 高效液相色譜（waters）、KQ-500DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、色 譜 柱（waters Symmetry C18，4.6×250 mm，5 μm）、Milli-Q 超純水制備儀（美國Millipore 公司）、SHZ-D Ⅲ循環水式多用真空泵（上海力辰邦西儀器科技有限公司）、Basis Hei-VAP HL 旋轉蒸發儀（Heidolph）、游標卡尺（上海精美量具廠）、 BSA224SCW 分析天平（德國Sartorius）、DHG-9240A 烘箱（上海一恒科學儀器有限公司）、卷尺等。

1.2.3 試 劑標準品補骨脂素（中國藥品生物制品檢定所，批號110739-201918，純度為99.60%），標準品佛手柑內酯（中國科學院成都生物研究所/成都曼斯特生物科技有限公司，批號19063003，純度為99.37%），水為超純水，其他試劑均為分析純 。

1.3 試驗設計

五指毛桃于2016—2019 年每年3 月在基地內劃區種植，離松樹2 m，種植密度為60 cm×60 cm，深15 cm×寬25 cm 開穴，以充分腐熟的廄肥2 kg 作基肥，與細土混勻施入穴內。種植區域生態環境基本一致，移栽時種苗大小一致，管理方法一致，2020 年2月測量生長狀況及補骨脂素和佛手柑內酯含量（移栽時的小苗作為CK）。

1.4 考察指標及方法

1.4.1 植物學性狀測定主要測定馬尾松樹林下種植1～4 a 的五指毛桃的株高、基徑、側根數、根長、最大根徑、地上部鮮（干）重，地下部鮮（干）重等指標。其中，地上部干重和地下部干重的測定：將鮮樣置于105℃烘箱里殺青30 min 后，轉到55℃下烘至恒重后稱量。每個生長年限選10 株大小均勻，根、莖、葉齊備的五指毛桃進行測量，取平均值。試驗數據采用Excel 和SPSS 軟件進行分析。

1.4.2 化學成分含量測定將五指毛桃根系樣品烘干后粉粹過40 mm 篩，用高效液相色譜法檢測不同生長年限樣品補骨脂素和佛手柑內酯的含量。（1）標準品溶液的制備。精密稱取補骨脂素標準品17.75 mg，佛手柑內酯標準品3.7 mg，加甲醇超聲使其溶解，分別制成1.775 mg/mL 的補骨脂素和0.37 mg/mL 的佛手柑內酯標準品溶液，0.45 μm 濾膜過濾。（2）樣品溶液的制備。取五指毛桃粉末0.5 g，精密稱定，置于50 mL 具塞錐形瓶中，精密量取10 mL 甲醇，超聲波提取30 min，定容至10 mL，0.45 μm 濾膜過濾。（3）檢測波長的選擇。取補骨脂素和佛手柑內酯標準品溶液通過紫外全波長掃描，根據最大吸收峰確定適宜的檢測波長。（4）其他色譜條件。色譜柱為waters Symmetry C18( 4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水（60 ∶40）；流速1.0 mL/min，柱溫35℃，進樣量10 μL。（5）標準曲線制備。精密稱取補骨脂素標準品和佛手柑內酯標準品溶液，用流動相溶液進行稀釋，分別制備濃度梯度為1.775、3.55、7.1、14.2、28.4、56.8 mg/L 的補骨脂素標準品溶液和濃度梯度為0.37、0.74、1.48、2.96、5.92、11.84 mg/L 的佛手柑內酯標準品溶液，在試驗確定的色譜條件下進行測定，以峰面積（Y）為縱坐標，以標準液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。（6）樣品的穩定性。樣品制備后，分別于0、1、2、4、8、12 h 取樣測定，考察樣品的穩定性。（7）檢測方法驗證。精密吸取標準品溶液，按照試驗確定的方法進行檢測，取相同濃度標準品重復測定5 次，以驗證方法的精密度；精密稱取同批次五指毛桃樣品5 份，制備待測樣品溶液，分別測定補骨脂素和佛手柑內酯的含量，以驗證方法的重復性；精密稱取同批次五指毛桃樣品5 份，精密加入補骨脂素（0.887 5 mg/mL）和佛手柑內酯（0.187 5 mg/mL）標準品1 mL，按樣品制備方法制備樣品溶液，分別測定補骨脂素和佛手柑內酯的含量，計算樣品的加標回收率。

2 結果與分析

2.1 樣品中補骨脂素和佛手柑內酯的檢測方法確定

試驗結果顯示，補骨脂素在245 和222 nm 處吸收比較強，佛手柑內酯在222 nm 處吸收較強，故選擇222 nm 作為補骨脂素和佛手柑內酯2 種物質的共同檢測波長。在該波長處，補骨脂素和佛手柑內酯標準品的保留時間分別為16.705 和25.556 min，五指毛桃樣品中補骨脂素和佛手柑內酯的保留時間分別為16.566 和25.353 min（圖1），分離度良好。研究采用外標法計算樣品中的補骨脂素和佛手柑內酯含量，通過標準曲線繪制，獲得補骨脂素和佛手柑內酯的回歸方程分別為Y=44 939.02X+0.308，r=0.999 99 和Y=60 244.50X-0.251，r=0.999 97。研究驗證了樣品的穩定性，結果顯示制備0～12 h 的樣品中補骨脂素和佛手柑內酯峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為0.85%、0.96%，表明供試樣品溶液在12 h 內穩定。研究還驗證了檢測方法的精密度和重復性，結果顯示在該檢測條件下，補骨脂素和佛手柑內酯峰面積的RSD 均低于1.5%，表明檢測方法的精密度、重復性良好。加標回收試驗結果顯示，補骨脂素和佛手柑內酯平均加樣回收率分別為99.7%（RSD=1.85%）和99.4%（RSD=1.97%），表明該檢測方法準確可靠。

圖1 五指毛桃中補骨脂素和佛手柑內酯的高效液相色譜結果

2.2 馬尾松林下不同生長年限五指毛桃植物學性狀比較

由表1 可知，在相同生態環境條件下，五指毛桃株高隨著生長年限的增加而增加，不同生長年限的五指毛桃株高差異顯著。一年生至四年生的五指毛桃株高逐年增長量分別為64.80、159.21、97.01、11.87 cm。四年生的株高最高，平均達341.35 cm，四年生的株高較三年生增加3.60%，三年生的較二年生增加41.73%，二年生的較一年生增加217.32%。可以看出，移栽后1～2 a 五指毛桃株高增加最快，是五指毛桃速生期，其次是第3 年，第4 年的株高增長緩慢。

不同生長年限的五指毛桃基徑差異顯著，生長年限越長，主莖越粗。二年生至四年生的五指毛桃基徑分別為2.27、3.09、3.35 cm；三年生的基徑比二年生平均增粗36.12%，四年生的基徑比三年生平均增粗8.41%，四年生的基徑年增粗率比三年生降低。二年生、三年生的五指毛桃基徑增粗顯著，四年生的差異減小，基徑增粗速度減慢。

五指毛桃側根數隨著生長年限的增加呈先快后慢的增長趨勢。一年生和二年生的側根數增加明顯，說明五指毛桃側根的數量增加主要在一年生和二年生階段，四年生與三年生的側根數差異不顯著。

不同生長年限五指毛桃根長差異顯著。四年生的根長最長，平均達131.72 cm，四年生的五指毛桃根長較三年生增加7.67%，三年生的較二年生增加11.36%，二年生的較一年生增加229.42%。可以看出，二年生的五指毛桃側根長得最快，其次分別是三年生和四年生。這與株高生長動態有些相似，說明移栽后1～2 a 五指毛桃株高和根長進入速生期。

表1 不同生長年限的五指毛桃主要生長性狀

表2 不同生長年限五指毛桃生物量變化動態 （g/株）

不同年限五指毛桃最大根徑差異顯著，生長年限越長，最大根莖越粗。二年生至四年生的五指毛桃最大根徑分別為1.40、2.12、2.63 cm，三年生的最大根徑與二年生的相比，增粗51.75%，四年生的比三年生增粗24.06%，二年生和三年生的根徑增粗率大，四年生的增粗率相對較小。

2.3 不同生長年限五指毛桃生物量變化動態

由表2 看出，不同生長年限鮮重和干重都差異顯著，與生長年限呈正相關關系。一年生至四年生的五指毛桃平均每株鮮生物量（地上部鮮重+地下部鮮重）分別為780.33、2 850.55、3 567.91、3 990.18 g，平均每株干生物總量（地上部干重+地下部干重）分別為246.00、1 047.38、1 565.78、2 021.85 g，二年生至四年生的鮮生物量分別較上一年增加2.65、0.25、0.12倍，干生物總量分別較上一年增加3.26、0.49、0.29 倍。五指毛桃生物量隨著生長年限的增加而增加，二年生的五指毛桃增長率最大，四年生的較三年生的增長速率有所降低。

五指毛桃以根部入藥，地下部是收獲目標，也是光合產物積累和儲藏的重要器官，五指毛桃根部生物量大小決定著產量和經濟效益。從表2 可以看出，一年生的五指毛桃幼苗移栽后，由于前期幼苗植株小，地上部生物量少，光合產物積累能力弱，限制了五指毛桃的生長速率，植株生長緩慢，到二年生后，進入旺盛生長期、大量積累光合產物，生物量迅速積累，總生物量迅速上升，增長量最大，之后隨著生長年限的增加，增長量呈現遞減趨勢。

2.4 不同生長年限對五指毛桃的補骨脂素和佛手柑內酯含量的影響

不同生長年限五指毛桃塊根的補骨脂素和佛手柑內酯含量有差異，說明生長年限對其質量有影響。由表3 看出，同一生長年限五指毛桃塊根的補骨脂素含量高于佛手柑內酯含量。三年生的五指毛桃塊根中的補骨脂素和佛手柑內酯含量較二年生和四年生的含量高。補骨脂素含量的高低順序均為：一年生＞三年生＞四年生＞二年生，佛手柑內酯含量的高低順序均為：一年生＞三年生＞二年生＞四年生。

表3 不同生長年限五指毛桃補骨脂素和佛手柑內酯含量比較

3 結論與討論

五指毛桃主根垂直向下生長，當長到一定程度時，生長緩慢，從根頸長出一定數量的側根。側根斜向下或者橫著生長，側根數量多且生長快。側根數、側根長和側根直徑決定五指毛桃的產量，因此以側根作為地下部生長性狀的測定對象，發現馬尾松林下二年生的五指毛桃株高、基徑、根長、最大根徑和生物量進入速生期，地上部鮮重平均值為1 860.38 g，地下部鮮重平均值為720.17 g，三年生增長量次之，說明五指毛桃可以在馬尾松林下進行林藥種植。

一年生五指毛桃塊根的補骨脂素和佛手柑內酯含量較高，可能是一年生的五指毛桃根較細小，以根皮為主，根莖量少。鐘鏡金等[15]研究發現五指毛桃根皮的補骨脂素和佛手柑內酯含量明顯高于根莖的含量。《中國藥典》尚未收錄五指毛桃質量標準，沒有參考補骨脂素和佛手柑內酯含量標準。馬雅婧等[16]建議參照藥典高效液相色譜法（附錄Ⅵ D）測定五指毛桃補骨脂素和佛手柑內酯含量，補骨脂素含量不低于0.05%。

林藥種植塊根類中藥材，需考慮中藥材的產量和經濟效益。林下粗放式種植中藥材，沒有施用農藥和化肥，屬于仿野生種植，一般的野生藥材，由于生長年份不詳，采收時大多為不同年限的藥材混合品，藥材質量差異大，林下種植可以避免這種缺陷，選擇在藥材最佳采收年限進行采收，達到質量均一、提高藥用效果的目的。補骨脂素和佛手柑內酯作為評價五指毛桃質量的重要依據，過早采收使得產量過低、藥用活性成分相對積累較少；采收過遲往往導致過于老化、品相差等。而補骨脂素和佛手柑內酯在一年生含量最高，之后含量下降，三年生又比二年生的含量高，表明五指毛桃活性物質含量不是生長年限越長越高，而是生長到一定年限后不再增加，反而降低。因此，選擇適宜的采收時期有利于品質的保證，三年生的五指毛桃補骨脂素和佛手柑內酯含量較高，兼顧地下部分干物質積累量，建議宜采收三年生的五指毛桃入藥。