黃芪丹參配伍提取物對心肌缺血大鼠的心臟保護作用

張瓅方， 李夢華

(1.南陽理工學院河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點實驗室， 南陽 473004； 2.南陽醫(yī)學高等專科學校， 南陽 473061)

心血管疾病尤其是缺血性心臟病，是全球范圍內(nèi)占據(jù)疾病死亡率的主要原因[1]。雖然多數(shù)患有心肌梗死(myocardial infarction，MI)的病人依靠化學藥物和經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coro-nary intervention，PCI)后癥狀得到改善，但仍有一部分患者因微血管病變、術(shù)后再狹窄和彌漫性病變等并發(fā)癥而無法接受有效治療。因此，探索新的治療策略來緩解MI缺血和維持心臟功能顯得尤為重要[2]。恢復缺血心肌的血供是治療MI的關(guān)鍵。隨著血管新生概念的發(fā)展，越來越多的研究證明治療性血管生成能有效改善MI血供[3]。血管生成是一個復雜的過程，其中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)等促血管生成因子能顯著促進缺血區(qū)側(cè)支血管的增殖，減少梗死面積[4-5]。然而，臨床中關(guān)于基因治療的效益仍然存在爭議，例如有限的有效期、促進腫瘤生長和其他安全問題等[6-7]。除了生長因子外，干細胞也有助于新血管形成。已經(jīng)證明，干細胞分泌可溶性旁分泌因子，并能夠分化為內(nèi)皮細胞[8-9]。

MI發(fā)病時典型臨床表現(xiàn)為心前區(qū)不同程度疼痛，這與中醫(yī)“胸痹”“真心疼”等病癥中胸部悶痛，嚴重時胸痛徹背、背痛徹心的主要癥狀極其相似。中醫(yī)治療此類疾病采用“益氣化瘀生新”理論和西醫(yī)“治療性促血管新生”概念有著異曲同工之處，課題組前期選用益氣活血類代表藥黃芪和丹參配伍提取物進行心肌梗死干預治療，證實了黃芪、丹參配伍提取物的濃度劑量和治療MI作用呈量效正相關(guān)關(guān)系[10]，在VEGF/KDR信號通路介導下，可上調(diào)血管成熟肽類生長因子(angiopoietin I，AngI)和血管內(nèi)皮特異性組織蛋白(endothelial nitricoxide sythase，eNOS),證實黃芪、丹參配伍提取物調(diào)控參與促血管生成因子作用明顯[11]。中藥配伍是中醫(yī)藥在臨床應用相容性的基本表現(xiàn)形式，黃芪和丹參組合是中醫(yī)治療心血管疾病的常用藥對。現(xiàn)以MI大鼠模型為研究對象，探討黃芪丹參配伍提取物對缺血性心肌的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 黃芪和丹參的制備

黃芪和丹參提取物在國家自然科學基金項目“黃芪丹參配伍提取物對心肌梗死后心室重構(gòu)中PKD-AP-1/C-Jun-MMPs信號傳導通路影響的研究(81173372)”基礎(chǔ)上，由南陽理工學院方藥研究所鑒定并提供蒙古黃芪干燥根經(jīng)和唇形科植物丹參干燥根經(jīng)，經(jīng)水提和大孔吸附樹脂純化法提取黃芪總苷含量66.9%，每克含原生藥32.21 g；丹參總酚酸含量63.7%，每克含原生藥15.46 g。

1.2 建立MI大鼠模型

實驗大鼠購自河南省實驗動物中心，SD大鼠 8 周齡雄性，體重(220±20) g[動物生產(chǎn)許可證：SCXK(豫)2015—0005；動物質(zhì)量合格證：1001297]。實驗前，將大鼠置于SPF環(huán)境條件下，在(26±1) ℃和55%±10%濕度條件下進行12 h明暗交替飼養(yǎng)1周。所有動物程序和方案均按照《實驗動物護理和使用指南》執(zhí)行，并經(jīng)南陽理工學院動物護理委員會的倫理準則批準進行(批準號：NYISTEEC—2017026)。參照經(jīng)典MI造模方法，以4%水合氯醛注射液麻醉大鼠后，通過結(jié)扎左前降支建立心肌梗死模型[12]。

1.3 分組及藥物管理

實驗分批進行，每組8只。第一批大鼠分為 6組，為假手術(shù)組(Sham，等量生理鹽水)、模型組(Model，等量生理鹽水)、培哚普利組[PB,3 mg/(kg·d)]國藥準字H20034053，施維雅(天津)制藥有限公司)、黃芪提取物組[HQ，50 mg/(kg·d)]、丹參提取物組[50 mg/(kg·d)]和黃芪丹參配伍提取物組[HQ+DS，50 mg/kg·d)]，以確定對心功能和MI區(qū)域百分比有最佳影響的中藥組。采用Notch抑制劑RO4929097(s1575,Selleckchem，UK)探討Notch1和NICD通路在中藥干預的缺血心肌血管生成中的作用。將第二批大鼠分為假手術(shù)組、模型組、HQ+DS組和HQ+DS+RO4929097[HQ+DS-I，10 mg/(kg·d)]組，觀察中藥對CD31和vWF的左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fractions,LVEF)和平均光密度(average optical densities,AODs)的影響。RO4929097以1%羧甲基纖維素和0.2%Tween80(C8621、T8360，北京索萊寶科技有限公司)配制為混懸液。從模型建立后第 2 d 開始，每天灌胃一次，自由活動和進食持續(xù) 21 d。第22天處死大鼠后將血清分離進行酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。在冰臺上快速取出心臟分為兩部，一部分4%多聚甲醛中室溫固定12 h后進行組織病理觀察，另一部分保存于-80 ℃冰箱進行Western blot檢測。

1.4 超聲評價左室射血分數(shù)

用小動物超聲成像儀(Vevo 3100，VisualSonics，Canda)檢測大鼠心臟。4%水合氯醛麻醉后將 MS-250 探針放在大鼠左胸上并指向右側(cè)，以獲得左心室的長軸視圖。每只大鼠測量3個連續(xù)心臟周期取平均值，并計算各組LVEF。

1.5 Masson染色法測定心肌梗死面積百分比

固定在4%多聚甲醛的大鼠心臟取出后在不同濃度的酒精中脫水。將脫水樣品嵌入石蠟包埋切片，并用Masson操作說明(G1006，武漢谷歌生物科技有限公司)進行連續(xù)染色。染色后的心肌樣本用數(shù)字切片掃描儀(Panoramic MIDI，3DHISTECH，Hungary)進行掃描。梗死心肌的像素以藍色為特征，正常心肌的像素以紅色為特征，采用ImageJ(Wayne Rasband，National Institutes of health，USA)計算。MI面積百分比計算為藍色像素/(藍色+紅色像素)×100%。

1.6 免疫熒光法檢測CD31和vWF

將上述切片后獲得的組織切片依次與CD31(GB12063，武漢谷歌生物科技有限公司)、vWF(GB11020，武漢谷歌生物科技有限公司)和DAPI(G1012，武漢谷歌生物科技有限公司)抗體培養(yǎng)。通過顯微鏡(DMIL-RF1，Leica,Germany)獲得梗死邊界區(qū)(IBZ)和心肌梗死區(qū)(MI)的照片(200×)。利用ImageJ計算CD31和 vWF積分密度和面積。CD31和vWF的平均光密度(AODs)計算為綜合密度/面積×100%。

1.7 測量VEGF和bFGF

ELISA法檢測VEGF(KE10009，Proteintech，USA)和bFGF(ab100670, Abcam, UK)，根據(jù)制造商提供操作步驟進行，全自動定量繪圖酶標儀(Epo-ch2, Biotek, USA)分析光密度。

1.8 Western blot法檢測HIF-1α、FGFR-1、Notch1/NICD、SDF-1、CXCR-4、CT-1

將RIPA蛋白提取試劑與蛋白酶抑制劑混合。用電動均質(zhì)機將組織勻漿后冰上孵育20 min，14 000g離心5 min，BCA法測定樣品的蛋白質(zhì)濃度，用RIPA緩沖液調(diào)節(jié)至最低濃度。在95 ℃下 5 min 裂解蛋白質(zhì)變性，預處理SDS聚丙烯酰胺凝膠，將樣品加載到凝膠上，進行電刺激，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%牛血清白蛋白進行封閉。與原發(fā)性抗體抗GAPDH(5174，CST，USA)孵育后，HIF-1α(36169，CST，USA)、FGFR-1(9740，CST，USA)、Notch1(3608，CST，USA)、NICD(4147S，CST)、SDF-1(3740，CST，USA)、CXCR-4(60042-1-1 g, Proteintech, USA)和CT-1(YT0638,ImmunoWay,USA)在4 ℃ 下，用二級抗體(115-035-003, Jackson, USA)室溫下培養(yǎng)2 h。用凝膠成像儀(ChemicDoc XRS+, Bio-Rad, USA)對膜進行成像，ImageJ進行分析。

1.9 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 HQ+DS對心臟功能的影響

2.1.1 LVEF比較

左前降支結(jié)扎后左心室收縮功能下降，心室壁運動異常。模型組與假手術(shù)組相比，LVEF明顯降低(P<0.001)。治療后，與模型組相比，PB組和HQ+DS組的LVEF均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。模型組與HQ組(P>0.05)和DS組(P>0.05)無顯著性差異[圖1(b)]。

2.1.2 MI面積比

非接觸區(qū)心肌細胞染色為紅色，Masson染色后梗死區(qū)呈藍色，梗死組織以膠原纖維和炎性細胞為特征。與假手術(shù)組相比，模型組和治療組心肌梗死面積/左心室面積的百分比明顯增加。治療后，與模型組相比，PB組、DS組和HQ+DS組心肌梗死面積/左室面積百分比明顯降低(P<0.05或P<0.01)[圖1(a)、圖1(c)]。

2.1.3 血清中VEGF和bFGF水平

模型組血清bFGF水平顯著低于假手術(shù)組(P<0.01)。治療后，PB組、HQ組、DS組和HQ+DS組中bFGF水平均升高，其中HQ+DS組bFGF水平較模型組明顯升高(P<0.01)[圖1(e)]。各組VEGF水平無顯著性差異(P>0.05)[圖1(d)]。HQ組、DS組和HQ+DS組的LVEF、心肌梗死面積百分比、VEGF和bFGF水平相比較，HQ+DS組對改善心臟功能的作用明顯優(yōu)于HQ組和DS組。

2.2 HQ+DS對心臟保護機制

2.2.1 抑制Notch信號后LVEF和MI面積測定及組織病理學觀察

Notch受體分裂后釋放NICD，NICD轉(zhuǎn)運到細胞核并能啟動基因轉(zhuǎn)錄，當分泌酶活性被RO4929097抑制時，NICD釋放受阻。實驗中，HQ+DS組LVEF與模型組相比有明顯改善，HQ+DS-I組與模型組LVEF無顯著差異[圖2(c)]。與模型組相比，HQ+DS組和HQ+DS-I組心肌梗死面積百分比降低(P<0.01或P<0.05)[圖2(d)]。這一發(fā)現(xiàn)表明Notch1/NICD通路可能在HQ+DS介導的心肌梗死后心臟功能保護中起重要作用，盡管它可能不是唯一通路。Masson染色顯示假手術(shù)組心肌細胞排列整齊，心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，僅有少量炎性細胞出現(xiàn)在HQ+DS組[圖2(a)]。模型組梗死區(qū)心肌斷裂溶解，伴有大量纖維增生紊亂，炎癥反應明顯，以大量浸潤性炎性細胞為特征[圖2(b)]。模型組和HQ+DS-I組炎癥反應強于HQ+DS組。

與假手術(shù)組相比，*為P<0.05，**為P<0.01，***為P<0.001；與模型組相比，$為P<0.05，$$為P<0.01；n=8圖2 Notch1/NICD通路對MI心肌保護作用Fig.2 The protective effect of Notch1/NICD pathway on MI myocardium

2.2.2 IBZ中CD31和vWF的AODs值

CD31和vWF是血管內(nèi)皮細胞的特異性標記蛋白，經(jīng)免疫熒光染色后CD31、vWF和DAPI呈現(xiàn)綠色、紅色和藍色。由于血管管腔小或模糊，很難計算血管數(shù)目，因此用CD31和vWF的AODs來評價血管生成密度。染色顯示新生血管呈綠點，細胞核呈藍色，染色均勻分布[圖3(a)、圖3(b)中假手術(shù)組]。在模型組中，因梗死導致缺血心肌細胞代償性肥大或部分溶解，細胞核和血管生成變得不規(guī)則或不均勻[圖3(a)、圖3(b)中模型組]。與假手術(shù)組相比，模型組和HQ+DS-I組中CD31的AODs顯著降低(P<0.001)，而HQ+DS組的CD31的AODs顯著增加(P<0.05)[圖3(c)]。IBZ中形成的毛細血管網(wǎng)絡(luò)用于改善缺血心肌的血液供應，與模型組相比，HQ+DS組細胞核密度更高[圖3(a)、圖3(b)中配伍組]。HQ+DS-I組與HQ+DS組相比，CD31的AODs降低。這一結(jié)果表明，Notch通路可能在HQ+DS介導的IBZ血管生成中起到促進作用。

與假手術(shù)組相比，*為P<0.05，**為P<0.01；與模型組相比，$為P<0.05；與HQ+DS組相比，&為P<0.05；n=8圖3 Notch通路在HQ+DS介導的IBZ血管生成中作用Fig.3 The role of Notch pathway in HQ+DS-mediated IBZ angiogenesis

2.2.3 MI中CD31和vWF的AODs值

MI區(qū)壞死組織不能完全溶解吸收，肉芽組織由新的毛細血管和成纖維細胞組成。MI區(qū)的病理過程與IBZ區(qū)不同，模型組CD31和vWF的AODs均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05或P<0.001)。模型組的細胞核比假手術(shù)組更致密，因為肉芽形成特點是血管生成、成纖維細胞增殖和炎癥細胞浸潤[圖4(a)、圖4(b)中模型組]。HQ+DS組和HQ+DS-I組與模型組相比，CD31和vWF的AODs降低(P<0.001)[圖4(c)]。

與假手術(shù)組相比，*為P<0.05，***為P<0.001；與模型組相比，$$$為P<0.001；n=8圖4 MI中CD31和vWF的AODs值Fig.4 AODs values of CD31 and vWF in MI

2.2.4 血清中VEGF和bFGF水平

與假手術(shù)組相比，模型組bFGF水平明顯降低(P<0.001)。與模型組相比，HQ+DS組和HQ+DS-I組的bFGF水平顯著升高(P<0.001)[圖5(b)]。各組VEGF水平無顯著差異(P>0.05)[圖5(a)]。

與假手術(shù)組相比，***為P<0.001；與模型組相比，$$$為P<0.001；n=8圖5 各組血清中VEGF和bFGF水平Fig.5 Serum levels of vascular endothelial growth factor and bFGF in each group

2.2.5 HIF-1α、FGFR-1、SDF-1、CXCR-4和CT-1的表達

血管生成涉及一系列生物學過程，干細胞動員也參與血管生成，因此實驗中檢測HIF-1α和FGFR-1的表達，此外還測定了SDF-1、CXCR-4和CT-1，以研究HQ+DS對干細胞動員的影響。模型組和HQ+DS組的HIF-1α表達明顯高于假手術(shù)組(P<0.001或P<0.01)。HQ+DS組HIF-1α表達下降(P<0.05)，而FGFR-1表達增加[圖6(a)]。在任何一組中，參與干細胞動員的CXCR-4表達沒有差異(P>0.05)。與假手術(shù)相比，模型組和HQ+DS組SDF-1和CT-1表達顯著增加(P<0.001或P<0.01)。HQ+DS組與模型組相比，SDF-1和CT-1表達顯著增加(P<0.01)[圖6(b)]。

2.2.6 Notch1和NICD的表達

Notch家族參與血管生成和干細胞分化。在本次實驗中，RO4929097被用來探討Notch/NICD通路在HQ+DS對血管生成的影響作用。HQ+DS組與模型組比較，增加了Notch1和NICD的表達(P<0.05)。經(jīng)過HQ+DS-I干預后，與HQ+DS組相比，Notch1和NICD表達降低(P<0.01或P<0.001)[圖6(c)]。

與假手術(shù)組相比，*為P<0.05，**為P<0.001，***為P<0.001；與模型組相比，$為P<0.05，$$為P<0.01；與HQ+DS組相比，&&為P<0.01；n=8圖6 Western blot檢測血管生成相關(guān)因子和干細胞動員蛋白的表達Fig.6 Western blot was used to detect the expression of angiogenesis-related factors and stem cell mobilization proteins

3 討論

黃芪和丹參是中醫(yī)益氣活血類的常用藥對組合，多應用于氣虛血瘀證的治療，尤其是在缺血性疾病應用中效過顯著，但黃芪丹參配伍使用對心臟的保護機制尚不明確。實驗結(jié)果表明，黃芪丹參配伍能顯著改善MI大鼠的LVEF，降低心肌梗死面積，效果優(yōu)于使用單味黃芪或丹參。黃芪丹參配伍增加了IBZ中CD31的AODs，證明黃芪丹參配伍對心臟的保護作用可能與促進血管生成有關(guān)。因缺血而誘導血管生成的關(guān)鍵問題是新生毛細血管能否有效增加血液供應，活血化瘀類中藥在特定組織中是否具有優(yōu)先作用，是值得進一步研究的課題。實驗結(jié)果表明，模型組形成更多肉芽組織，并以新生血管為特征，提示梗塞區(qū)新生血管可能只促進肉芽組織成熟，加速梗塞心肌纖維化，導致缺血組織供血減少。血管生成主要由組織缺氧通過HIF-1α激活來刺激[13]。HIF-1α激活許多基因的轉(zhuǎn)錄，包括血管內(nèi)皮生長因VEGF、血管內(nèi)皮生長因子受體flt-1和bFGF[14-15]。bFGF是一種有效的血管生成因子，可刺激參與血管生成和肉芽組織形成的成纖維細胞和內(nèi)皮細胞的增殖。HQ+DS組和模型組的HIF-1α和FGFR-1表達均明顯高于假手術(shù)組，HQ+DS組的HIF-1α表達較模型組下降，HIF-1α的表達受氧濃度的嚴格影響。低氧條件下，HIF-1α的泛素化和降解受到抑制，由此產(chǎn)生的HIF-1α在細胞質(zhì)中的積累刺激多種血管生成因子，包括bFGF[16]。HQ+DS組的HIF-1α表達下降，提示HQ+DS對治療后缺血心肌氧濃度升高。干細胞療法為缺血性新血管形成提供了很好的治療潛力，已經(jīng)證明，SDF-1與CXCR-4結(jié)合在一起，有助于動員干細胞并將其招募到缺血組織中[17-18]。SDF-1不僅有助于植入骨間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的歸巢，而且還可以增加缺血時的血管密度并誘導血管生成[19]。CT-1是一種強有力的細胞因子，促進細胞植入，通過促進骨間充質(zhì)干細胞的持續(xù)性和黏附性來維持梗塞心臟的功能[20]。研究還表明，CT-1可促進干細胞的心臟分化[21-22]。研究結(jié)果表明，HQ+DS顯著增強了SDF-1和CT-1的表達，提示干細胞可能被動員到缺血心肌中，以保護受損組織。然而，HQ+DS調(diào)控干細胞促進缺血性心肌細胞的血管生成的機制需要進一步研究。

Notch信號控制血管網(wǎng)的血管生長、內(nèi)皮細胞增殖和動靜脈的分化[23]。哺乳動物細胞中有4個受體(Notch1-4)和5個配體(DII1、DII3、DII4、Jaggedl、Jagged2)。一旦Notch配體與其受體結(jié)合，Notch信號就發(fā)生，Notch受體從細胞膜釋放NICD。NICD轉(zhuǎn)移到細胞核調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，從而影響細胞的增殖和分化[24]。Notch1/NICD參與缺血組織的血管生成，有利于干細胞向心肌細胞分化[25-27]。在本研究中，HQ+DS上調(diào)了Notch和NICD的表達，并在Notch分泌酶被抑制后不再增加NICD的水平，提示Notch1/NICD信號可能在HQ+DS介導的缺血心肌血管生成中起到重要作用。然而，缺氧是否影響Notch激活仍不清楚。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，HQ+DS對MI大鼠的心臟保護作用可能取決于其在缺血區(qū)的促血管生成作用。此外，Notch信號和干細胞動員都可能參與HQ+DS促進的血管生成。研究結(jié)果有助于加深對活血化瘀類中藥的認識，為HQ+DS作為心肌缺血相關(guān)疾病的治療或聯(lián)合治療提供更多的治療依據(jù)。