血紅蛋白A2在靜止型和標準型α-地中海貧血篩查中的價值探討

王玉霞 戴慶福 林玉梅 盧永芳 曹春芳

地中海貧血（地貧）是由于珠蛋白鏈合成減少或缺乏所致的一種遺傳性溶血性貧血，是我國南方地區最常見、危害最大的單基因遺傳病之一，其中廣西、廣東、海南最為嚴重[1]，福建亦為地貧高發區[2]。臨床上根據珠蛋白肽鏈受損類別的不同，主要分為α-地貧和β-地貧兩種，以α地貧為主，尤其以東南亞缺失型常見[3]。由于中、重型α-地貧患者預后不良，現階段尚無根治的方法，因此，如何有效開展婚前、孕前篩查及時發現基因攜帶者和加強產前診斷是防止重型地貧兒出生的有效手段。目前，臨床上地貧的診斷主要依賴常規血液分析各紅細胞參數，再進行血紅蛋白電泳，根據HbA2含量降低或升高初步分為α或β-地貧者，最后進行基因診斷分型。一般認為HbA2含量降低（<2.5%）疑為α-地貧，但靜止型和標準型α-地貧患者其含量常出現降低不明顯或正常現象，極易導致被漏篩[4-5]。為進一步了解HbA2對α-地貧初篩的效果，本研究對近年來檢出的靜止型和標準型α-地貧患者的HbA2含量與基因檢測結果進行了相關性研究，并對可能影響HbA2檢測結果的缺鐵因素進行分析，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年5月-2017年12月，在筆者所在醫院進行血液分析、血紅蛋白電泳篩查、血清鐵蛋白及地貧基因檢測的疑為地中海貧血的8 979例患者為研究對象，其中男1 167例，女7 811例，年齡1～90歲，平均（46.56±3.31）歲。疑似地貧患者診斷標準：（1）血細胞分析指標MCV<80 fl或MCH<27 pg；（2）無其他感染性疾病或血液性疾病；（3）無其他嚴重內科慢性疾病或并發癥。地貧缺鐵組及對照組納入標準：（1）通過地貧基因檢測確診為靜止型和標準型患者；（2）血清鐵蛋白檢測結果，男性<30 μg/L，女性<15μ g/L；（3）對照組為血細胞分析指標MCV<80 fl或MCH<27 pg，但地貧基因檢測正常且血清鐵蛋白檢測男性<30 μg/L，女性<15 μg/L。

1.2 儀器與試劑

血細胞分析采用日本Sysmex XT-2001i全自動血細胞分析儀及配套試劑和質控品；血紅蛋白電泳HbA2含量測定，采用法國Sebia全自動毛細管電泳分析儀自動掃描系統分析及配套試劑和質控品；血清鐵蛋白檢測，采用羅氏E601全自動電化學發光免疫分析儀和原裝配套進口試劑及質控品；基因擴增采用ABI 2720基因擴增儀，DNA提取及檢測試劑均為深圳亞能生物技術公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 標本采集 患者取半坐臥位，在30 s內先后收集患者靜脈血4 ml分別置入于EDTA-K2抗凝的紫色真空采血管和內含有分離膠的黃色真空采血管中，立即混勻后送實驗室進行血細胞分析、血紅蛋白A2含量測定、血清鐵蛋白的測定。

1.3.2 血細胞分析 采用XT-2001i全自動血細胞分析儀檢測，主要觀察指標為MCV、MCH，當患者MCV<80 fl和MCH<27 pg時進行血紅蛋白電泳分析，觀察血紅蛋白A2含量。

1.3.3 血紅蛋白電泳（HbA2含量測定） 將采集的靜脈血標本以5 000 r/min速度離心5 min，加樣槍吸取90 μl溶血素于稀釋杯，再加18 μl離心后的紅細胞層標本于稀釋杯中進行溶血稀釋，然后用儀器進行檢測。每批樣本均同時使用儀器的配套質控品進行質控后，對所有的樣本處理結果進行記錄。血紅蛋白電泳HbA2篩查標準：HbA2<2.5%或出現異常血紅蛋白區帶，則為α-地貧初篩陽性。

1.3.4 血清鐵蛋白檢測 采用羅氏E601全自動電化學發光免疫分析儀及配套試劑檢測血清鐵蛋白。血清鐵蛋白正常參考范圍：男性 30～400 μg/L，女性 15～150 μg/L。

1.3.5 α-地貧基因診斷

1.3.5.1 DNA樣本的提取 取患者抗凝血2 ml，吸200 μl全血于吸有500 μl WB裂解液的試管中振蕩均勻，短暫離心后加入100 μl沉淀液PB，振蕩均勻后12 000 r/min速度離心5 min，將上清加入離心柱中，分別依次加入已加入無水乙醇的W1一次，W2兩次，棄濾液，取出離心柱，于1.5 ml干凈離心管，加入100 μl洗脫液EB，離心后，離心管內即為收集備用的DNA溶液。

1.3.5.2 α-地貧3種缺失型診斷 采用跨越斷裂點（Gap-PCR）方法診斷中國人常見的α-地貧3種缺失型：東南亞缺失型（--SEA）基因、-α3.7缺失型基因和-α4.2缺失型基因；采用gap-PCR 和反向點雜交芯片技術（RDB），對α-地貧常見的3種非缺失型點突變基因進行檢測，包括α2珠蛋白基因突變類型 αWS CD122），CAC-CAG；αQS（CD125），CTG-CCG；αCS（CD142），TAA-CAA。缺失型采用通過電泳來判斷結果，突變型采用反向斑點雜交方法，根據顯色情況判斷結果。

1.4 統計學處理

本文數據資料分析采用SPSS 20.0統計學軟件進行處理。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HbA2正常的靜止型和標準型α-地貧中不同基因型所占比例

8 979例疑為地貧血患者中檢出為靜止型和標準型α-地貧3 588例，陽性率為39.96%。其中HbA2正常2 980例，占83.05%（2 980/3 588），HbA2異 常 608例，占 16.94%（608/3 588），見表 1。

2.2 靜止型和標準型α-地貧基因突變與缺失情況

從基因突變的類型看，靜止型和標準型α-地中海貧血中無論HbA2是否正常均以缺失型為主，分別為97.71%（3 506/3 588）、93.91%（571/608），兩者間比較差異無統計學意義（P>0.05）。在缺失型中東南亞缺失型雜合子（--SEA/αα）2 942例，占比最高為82.00%（2 942/3 588），其次為右缺失型雜合子（-α3.7/αα）394例，占 10.98%（394/3 588），左缺失型雜合子（-α4.2/αα）168例，占4.68%（168/3 588）；而非缺失型只占2.29%（82/3 588），其中ααQS/αα突變22例，占 0.61%（22/3 588），ααCS/αα突 變 45例，占 1.25%（45/3 588），ααWS/αα突變15例，占0.42%（15/3 588），見表1。部分缺失型α-地貧基因檢測電泳圖譜見圖1。

表1 3 588例靜止型和標準型α-地貧基因類型在HbA2正常中的占比

圖1 部分缺失型α地貧基因檢測電泳圖譜

2.3 缺鐵與HbA2含量的關系

在2 980例靜止型和標準型α-地貧HbA2含量正常的患者中，檢出1 379例血清鐵蛋白降低。檢測結果顯示，血清鐵蛋白<15 μg/L女性鐵缺乏患者841例（地貧缺鐵組）占60.98%（841/1379），HbA2平均含量為（2.2±0.23）%，對照組530例為（2.4±0.24）%，兩者間差異無統計學意義（P>0.05）；血清鐵蛋白<30 μg/L男性鐵缺乏患者538例（地貧缺鐵組）占39.01%（538/1 379），HbA2平均含量為（2.39±0.25）%，而對照組310例含量為（2.5±0.24）%，兩者間差異亦無統計學意義（P>0.05），見表2。

表2 血清鐵蛋白降低與HbA2含量的關系 [%，（±s）]

表2 血清鐵蛋白降低與HbA2含量的關系 [%，（±s）]

性別 組別 HbA2含量 P值女性 地貧缺鐵組（n=841） 2.20±0.23 >0.05對照組（n=530） 2.40±0.24男性 地貧缺鐵組（n=538） 2.39±0.25 >0.05對照組（n=310） 2.50±0.24

3 討論

α-地貧在臨床上分為4種類型：靜止型、標準型、中間型（Hb H病）、重型（Hb Bart’s水腫胎），其分型的機制是根據α-肽鏈基因缺失或突變的個數來劃分。重型Hb Bart’s水腫胎患兒有4個α-肽鏈基因缺失或突變，常在妊娠晚期中死于宮內中，或出生后幾小時內一般都會死亡。中間型Hb H 病患者有3個α-肽鏈基因缺失或突變，患者為長期輕度或中度貧血，重者可有黃疸，約2/3以上的患者有肝脾腫大，血象出現小細胞低色素改變，紅細胞滲透脆性下降及壽命期縮短等癥狀。靜止型和標準型患者α-肽鏈基因缺失或突變數量較少為1～2個，在臨床表現上可無臨床癥狀或僅輕微，但按照孟德爾遺傳規律，其孕育的胎兒有可能產生中間型或重型α-地貧兒。目前地貧患者沒有有效的藥物治療，主要依靠預防，因此如何加強對靜止型和標準型α-地貧的篩查尤為重要。

本研究表明，在采用MCV和MCH兩項指標篩查后的可疑地貧患者中靜止型和標準型α-地貧陽性率達39.96%，而且其中HbA2正常者占其大部分，為83.05%。從表1結果可以看出，HbA2對靜止型和標準型α-地貧的篩查存在較多漏診，不宜依靠HbA2結果對該類患者進行α-地貧篩查。因此，目前采用MCV、MCH和HbA2這種篩查方式可導致很大部分的靜止型和標準型α-地貧漏診，應引起足夠的重視。分析其原因可能與地貧患者易發生多樣化的血紅蛋白變體有關[6]。雖然常規MCH、MCV檢測操作簡便且成本低，對地貧患者篩查有一定的可行性，但其靈敏度及特異度不高，容易出現漏診現象[7-9]。本文研究表明，HbA2在靜止型和標準型α-地貧中有很大部分是正常的，這就導致很多地貧患者可能被漏篩，由于HbA2對靜止型和標準型α-地貧篩查沒有特異性，地中海貧血基因攜帶者的臨床表型又有很高的異質性，而基因診斷是地中海貧血確診的金標準[10]，才能更好地檢出攜帶者。我們建議應對所有的可疑患者都應進行地中海貧血基因檢測，同時無法明確病因或血液學、血紅蛋白分析異常，應加強α-地中海貧血的遺傳咨詢及產前基因診斷具有重要意義。

地貧不僅僅由于珠蛋白基因缺失或突變導致Hb成分改變，幼紅細胞利用鐵也發生障礙[11]，導致患者血清鐵增高[12]，但靜止型和標準型α-地中海貧血患者可使血清鐵蛋白降低[13]。本研究同時對可能影響HbA2的缺鐵因素進行了探討，結果表明，當女性患者血清鐵蛋白<15 μg/L或男性患者血清鐵蛋白<30 μg/L時，應該考慮缺鐵HbA2含量產生一定的影響，在地貧初篩時應予以考慮。這與相關研究報道相符[14-15]。α-地貧MCV及MCH假陽性主要以小細胞低色素貧血為主，致病原因較多，一般因缺血引起的貧血中有表現為MCH、MCV降低，初篩為地中海貧血患者中也有部分患者屬于缺鐵性貧血所致，因此，初篩為地貧的患者需經過血清鐵蛋白檢測排除，降低地中海貧血假陽性發生，減少對地中海貧血和珠蛋白生成障礙性貧血并發缺鐵性貧血（IDA）的誤診[16]。受檢者HbA2雖然處于正常范圍，但由于MCV或MCH異常，同樣有必要進行基因檢測，以免漏診。

綜上所述，HbA2在靜止型和標準型α-地中海貧血患者篩查中，具有一定的價值，但易導致漏診發生和缺鐵的干擾。因此，HbA2作為地中海貧血的有力篩查手段，應配合血細胞指標CMV、MCH和基因診斷才能更好地為臨床確診提供靠依據。