糞便鈣衛蛋白檢測在早產兒壞死性小腸結腸炎的應用

方凌毓 童小梅 傅春燕 許景林 陳冬梅

壞死性小腸結腸炎是多發于新生兒時期的嚴重消化道疾病，也是導致早產兒、低體質量兒死亡的重要原因。疾病初期無其他特異性癥狀，常規實驗室檢查在診斷壞死性小腸結腸炎中缺乏特異性，導致行腹部X線確診時病情已處于危重狀態[1-2]。鈣衛蛋白是反映急性炎癥反應的標志物，而糞便中的鈣衛蛋白（fecal calprotectin，FC）是中性粒細胞的標志性蛋白，與腸道炎癥間存在密切聯系，其水平的高低可反映腸道炎癥的嚴重程度，因其具有較高的敏感性及特異性，可將其用于評估腸道疾病嚴重程度的重要指標[3-4]?；诖?，本研究分析FC在早產兒壞死性小腸結腸炎中的應用效果，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年3月-2019年9月筆者所在醫院新生兒科收治的早產兒壞死性小腸結腸炎（NEC）患兒25例作為觀察組。NEC診斷標準：按照文獻[5]《實用新生兒學》（第4版）修正Bell分期標準進行診斷和分期，選擇Ⅱ期及以上的病例作為確診病例。納入標準：符合上述診斷標準，伴有體溫不穩定、呼吸暫停、血小板降低、代謝性酸中毒；胃內殘奶量增加，糞便中帶血，腸鳴音消失，大便潛血陽性，腹部壓痛明顯；腹部X線平片顯示腸充氣或功能性梗阻，或腸壁囊樣積氣，或門靜脈積氣。排除標準：存在其他消化系統疾??；合并其他系統感染性疾病者。其中男14例，女11例；出生胎齡29～35周，平均（31.86±1.06）周；出生體重（1 473.29±68.44）g；疾病嚴重程度：Ⅱ級16例，Ⅲ級9例。另選取同期住院的無胃腸道疾病早產兒按出生胎齡、出生體重和入院時間進行1∶1配對，共25例作為對照組，男12例，女13例；出生胎齡29～35周，平均（31.72±1.13）周；出生體重（1 556.42±59.38）g。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05）。本研究對象家屬均簽署知情同意書

1.2 方法

觀察組患兒于禁食24h、72 h及重新開奶時留取糞便樣本，對照組僅留取觀察組患兒禁食24 h和開奶同日的糞便樣本，糞便量0.5～1.0 g，所有收集的糞便樣本均放入無菌塑料管中，隨后將糞便樣本放置于-70 ℃冰箱（美國Thermo Scientific公司）內無菌密封冷凍，從-70 ℃低溫冰箱內將糞便樣本取出，于室溫下解凍，將裝有3 ml稀釋液的15 ml離心管連同采樣勺一起稱重，刮取50 mg糞便樣本，放入裝有稀釋液的離心管中，隨后將樣本放置于型號為QL-901渦旋混合儀上，待樣本無明顯塊狀時放置于德國Heraeus公司生產的離心機內行離心處理，設置離心機轉速為5 000 r/min，離心處理5 min后留取上層清液。取50 μl上層清液放置于700 μl稀釋液中，于1.5 ml EP試管中，充分混勻。另取90 μl至FC檢測卡，計時15 min后進行檢測，檢測所得結果×4.5即為實際FC濃度，若檢測值<15 μg/g（低濃度樣本），建議稀釋5倍，結果×5×15/50（1.5）即為FC濃度；若檢測值>2 100 μg/g（高濃度樣本），建議稀釋60倍，結果×60×15/50（18）即為FC濃度。

1.3 觀察指標

檢測觀察組在禁食24、72 h及重新開奶時的FC水平，分別表示為FC1、FC2、FC3，于觀察組患兒禁食24 h和開奶同日檢測對照組FC濃度，分別表示為FC1、FC3；對比禁食時觀察組及對照組FC水平，比較觀察組不同疾病分期患兒在禁奶24、72 h及重新開奶時FC水平；采用ROC曲線分析FC在早產兒壞死性結腸炎中的診斷價值。

1.4 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行數據處理，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組FC水平比較

觀察組FC1水平高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），兩組FC3水平比較差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

表1 兩組FC水平比較 [μg/g，（±s）]

表1 兩組FC水平比較 [μg/g，（±s）]

組別 FC1 FC3觀察組（n=25） 2 547.34±784.39 130.76±43.28對照組（n=25） 180.50±25.37 134.36±56.73 t值 15.079 -0.252 P值 <0.001 0.802

2.2 觀察組不同分期FC水平比較

觀察組Ⅲ期FC1、FC2水平均高于Ⅱ期，差異均有統計學意義（P<0.05），不同分期FC3水平比較差異無統計學意義（P>0.05），見表 2。

表2 觀察組不同分期FC水平比較 [μg/g，（±s）]

表2 觀察組不同分期FC水平比較 [μg/g，（±s）]

分期 FC1 FC2 FC3Ⅱ期NEC（n=16） 2 504.48±639.22 735.21±106.37 129.86±38.54Ⅲ期NEC（n=9） 4 382.29±803.16 1 972.38±92.48 138.30±45.39 t值 -6.433 -29.180 -0.439 P值 <0.001 <0.001 0.626

2.3 診斷價值

繪制FC濃度診斷早產兒壞死性小腸結腸炎的ROC曲線，截斷值為1 174.95 μg/g，靈敏度為92%，特異度為92%，約登指數為84%，曲線下面積為0.941，見圖1。

圖1 FC的ROC曲線

3 討論

目前，對于早產兒壞死性小腸結腸炎發病機制暫無明確定義，認為壞死性小腸結腸炎的發生與未發育成熟的腸道上皮細胞及對各種損傷因素間產生的不可控性級聯炎癥反應存在密切聯系[6]。由于早產兒壞死性小腸結腸炎早期病情無典型癥狀，傳統實驗室檢查在診斷壞死性小腸結腸炎中缺乏特異性及敏感性，而行常規腹部X線檢查在確診時病情已發展為危重期[7-8]。故早期診斷及治療干預對改善患兒預后具有重要作用。

醫學研究顯示，炎癥反應與壞死性小腸結腸炎的發生存在密切聯系[9]。正常生理條件下，維持人體腸道內環境的穩定需保持抗炎及促炎間處于平衡狀態。一旦發病，抗炎及促炎間的平衡將被打破，在促炎因子等作用下，炎癥細胞將在腸道黏膜中逐漸聚集、趨化，最終引發腸道損傷。鈣衛蛋白是從中性粒細胞中分離出來的一種具有抗微生物作用的蛋白，與鈣離子結合后具有較好的抗蛋白酶活性。故鈣衛蛋白結構不會被細菌或各種酶所破壞，可在外界環境及腸腔內得到長時間保存，同時保持其狀態穩定[10]。此外，鈣衛蛋白在人體內分布較為廣泛，于血清、糞便、腦脊液等組織中均檢測到，在臨床上多用于診斷炎癥性腸病。壞死性結腸炎是與腸道炎癥反應密切相關的疾病，當腸道炎癥反應發生時，中性粒細胞等炎癥細胞極易滲出腸腔，使得炎癥細胞因子水平明顯上升，加之新生兒自身腸道屏障發育不成熟，腸道通透性較高，大大增加腸腔中中性粒細胞數量[11-12]。本研究結果顯示，觀察組FC水平高于對照組，表明患兒在發生腸道炎癥時，中性粒細胞向腸腔排出量明顯增多，釋放出大量的鈣衛蛋白，使得FC水平較高。FC水平在疾病早期出現明顯上升現象，在懷疑患兒為壞死性小腸結腸炎時，可通過對FC水平的測定明確病情。觀察組Ⅲ期FC1、FC2水平均高于Ⅱ期，且不同分期FC3水平比較差異無統計學意義，提示FC水平隨著病情嚴重程度的增加而增加，禁食后隨著胃腸道的恢復，FC水平明顯下降，故可將FC水平的測定作為腸道損傷嚴重程度及恢復的指標，可有效避免因長時間禁食導致的生長發育遲緩等，同時還可避免過早腸內喂養所引發的腸道損傷加重病情。FC值為1 174.95 μg/g時，在早產兒壞死性結腸炎診斷中敏感度和特異度均92%，曲線下面積為0.941。由此可見，對FC水平實施動態監測有助于及時發現疾病，同時還可用于評判疾病的治療效果。

綜上所述，對早產兒實施動態FC監測，有助于盡早發現壞死性小腸結腸炎，同時可給予輔助評判疾病的治療效果，從而預測重新腸內喂養時機，具有較高的推廣價值。