蘭花育種及產業化技術研究進展

朱根發，楊鳳璽，呂復兵，李 佐，陳和明，高 潔，肖文芳，任 銳，魏永路，金建鵬，陸楚橋

（廣東省農業科學院環境園藝研究所/廣東省園林花卉種質創新綜合利用重點實驗室，廣東 廣州 510640）

蘭花是蘭科植物的總稱，有5個亞科801屬28 237種，是單子葉植物第一大科［1］，約占所有種子植物種類的10%。蘭花花形奇特，屬種差異大，花色豐富，不少蘭花散發出沁人的幽香，深受世界各國人民喜愛。蘭屬（Cymbidium）小花型地生種，俗稱國蘭，在我國有悠久的栽培歷史，是世界上最早栽培的蘭花［2］。經過近150多年的研究和推廣，已發展形成了7大商品化的蘭花，除蘭屬外，這些商品化的蘭花品種還包括蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis）、石斛蘭屬（Dendrobium）、卡特蘭屬（Cattleya）、兜蘭屬（Paphiopedilum）、文心蘭屬（Oncidium）和萬代蘭屬（Vanda）。隨著全球蘭花市場的繁榮和出口貿易的發展，對于蘭花育種技術的突破以及產業化升級的需求不斷增加。從品種到產業，其中涉及多方面的技術集成。蘭花資源的收集、保存和鑒評是育種的基礎和前提，蘭花資源的保存技術研究主要包括活體保存、離體保存和花粉貯藏保存，幾種保存方式互相補充、結合，以達到有效保護種質資源的目的。目前我國蘭花品種的選育仍以傳統育種方式為主，主要包括選擇育種（野生資源馴化篩選）、雜交育種等，但鑒于傳統育種存在的育種年限長、工作量大等實際問題，伴隨著技術革新，出現了更多的育種方法，例如倍性育種法、體細胞無性系變異法，尤其是近幾年依托遺傳多樣性和親緣關系、功能基因分離和驗證以及遺傳連鎖圖譜的構建等研究形成的蘭花分子育種方法，為蘭花育種提供了更多可能。在現代分子育種技術迅速發展的同時，與之相應的新品種種苗高效繁育、設施栽培與標準化管理、花期精準調控以及病蟲害防控等產業化配套技術的研發與應用成效顯著。

1 蘭花研究文獻

通過主題和關鍵詞Orchid（蘭花）、Cymbidium（蘭屬）、Phalaenopsis（蝴蝶蘭）、Dendrobium（石斛蘭）、Paphiopedilum（兜蘭）、Cattleya（卡特蘭）、Oncidium（文心蘭）和Vanda（萬代蘭）在中國知網總庫進行檢索，共獲相關文獻12 355篇，其中中文期刊占49.5%，外文期刊占33.6%，碩（博士）學位論文占9.6%，中外會議論文合4.2%（表1）。

根據搜索到的文獻分析可以看出，蘭花研究已受到越來越多的重視。“十三五”國家重點研發專項已將蘭花列為重點支持的6大花卉種類之一，在國家自然科學基金共享服務網查到獲得資助的蘭花研究項目有194項，其中廣東省農業科學環境園藝研究所（原花卉研究所，以下簡稱“環藝所”）獲資助7項，包括面上項目3項、青年基金4項。近20年發表的蘭花研究論文數量逐年增加（圖1），占總發文量89.5%，其中近10年的發文量占64.0%，標注國家基金資助論文919篇（表1）。2002年起，石斛蘭的每年發文量達50篇以上，且逐年增加，2009年起每年發文超過200篇，2017年發文量高達485篇。2003年起，蝴蝶蘭的發文量每年達50篇以上，2010年高達119篇，此后每年保持在90篇左右。蘭屬的發文量從2005年起，每年達50篇以上，2010年高達126篇，此后略有下降。兜蘭、文心蘭、萬代蘭和卡特蘭的研究相對較少，近10年平均每年發文量分別為24、22、10、6篇。

表1 蘭花研究相關文獻檢索結果Table 1 Related literature of orchid research

圖1 2000年以來發表的蘭花文獻數量Fig. 1 Orchid literatures published since 2000

環藝所自1984年成立以來，一直致力于蘭花研究和產業推廣應用，共承擔了各級科研項目200余項，發表論文300余篇，其中發表蘭屬研究論文42篇，5篇［4-8］居被引頻次前50位；蝴蝶蘭論文88篇，2篇［9-10］居被引頻次前50位，王懷宇［9］發表的《蝴蝶蘭快速無性繁殖》是被引次數最多的蝴蝶蘭文獻；石斛蘭論文33篇；兜蘭論文9篇，3篇［11-13］居被引頻次前50位；文心蘭論文10篇，5篇［14-18］居被引頻次前50位。出版著作17部；在英國皇家園藝學會（RHS）上登錄蘭花雜交種99個，選育出40個蘭花新品種通過廣東省農作物品種審定，8個新品種獲得國家植物品種權證書；獲國家授權發明專利15件，軟件著作權11件；制定國家農業行業標準1項；獲各級科技成果獎勵22項，其中國家科技進步二等獎1項、省科學技術一等獎2項，總體研究水平處于國內前列。此外，還發起成立中國蘭花協會（后更名為中國花卉協會蘭花分會），創辦中國蘭花博覽會、《中國蘭花》雜志、中國蘭花品種注冊登記、中國蘭花產業發展論壇等，對推動中國蘭花產業發展做出了重要貢獻。

2 蘭花育種研究

2.1 資源收集、保存與鑒評

種質資源是育種和產業發展的基礎。蘭花資源已受到越來越多單位的重視，我國科學院系統的植物園大多設有蘭科植物專類園或者保存溫室，并開展了蘭科植物的遷地保護工作；在中國花卉協會批準建設的兩批69家國家花卉種質資源庫中，蘭花資源庫10家。環藝所從20世紀80年代初就開展了蘭花種質資源收集與研究，在有關政府部門的大力支持下，建有國家蝴蝶蘭、墨蘭種質資源庫和廣東省名優花卉種質資源圃，收集保存各類蘭花資源1 365份，并廣泛開展了資源鑒評研究，利用染色體壓片技術或流式細胞儀檢測技術對69份蝴蝶蘭［3］、56 份大花蕙蘭［4］、20 份墨蘭［5］、78份石斛蘭［6］、34 份兜蘭［7-8］、12 份文心蘭［9］等進行種質資源的倍性鑒定或核型分析；采用AFLP或RAPD、SRAP和SSR分子標記對54份大花蕙蘭［10-11］、42 份墨蘭［12］、84 份蓮瓣蘭［13］、100份石斛蘭［14］等開展了遺傳多樣性與親緣關系分析或雜種后代的鑒定，并利用表型數據與SSR分子標記構建了蝴蝶蘭核心種質庫［15］。

2.2 基因組與功能基因挖掘

隨著新一代大規模測序技術的迅速發展，蘭科植物中已有小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）［16］、鐵皮石斛（Dendrobium of ficinale）［17］、深圳擬蘭（Apostasia shenzhenica）［18］和白花蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphrodite）［19］等 4個物種先后完成了高質量的參考基因組測序與組裝。研究發現，蘭科植物在白堊紀/ 古近紀的分界線附近發生一次特異性WGD事件，隨即在短期內通過基因的丟失或擴張，分化為5個亞科。其中，擬蘭亞科丟失的基因最多，樹蘭亞科最少；通過不同蘭科植物及其外圍物種的基因組的比較發現，M β MADS-box基因的丟失，致使現有蘭科植物的種子無胚乳；擬蘭亞科丟失了B-AP3 和E類旁系同源基因，導致它們的花返祖到原始狀態；而樹蘭亞科丟失了MIKC*類的P-亞類基因，致花粉凝結成花粉塊［31］。此外，AGL12基因的丟失和ANR1基因的收縮使蘭科植物能夠成功附生在樹木或巖石上，花粉塊和附生習性的形成都提升了蘭科植物的適應性［20-21］。

隨著遺傳和物理圖譜構建技術以及多組學技術結合新型的分子生物學手段的應用，越來越多的蘭科植物特異和功能性基因資源被發掘。臺灣成功大學熱帶植物研究所建立了OrchidBase3.0［22］，收集了包括蘭科5個亞科的10 種蘭花，包括擬蘭亞科的深圳擬蘭（A. shenzhenica）和麻栗坡三蕊蘭（Neuwiedia malipoensis）、香莢蘭亞科的深圳香莢蘭（Vanilla shenzhenica）和山珊瑚（Galeolafaberi）、杓蘭亞科的兜蘭（Paphiopedilum spp）和杓蘭（Cypripedium spp）、蘭亞科的厚瓣玉鳳蘭（Habenaria delavayi）和長距舌喙蘭（Hemipiliaforrestii）、樹蘭亞科的墨蘭（Cymbidium sinense）和小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）的花器官轉錄組數據，用戶可以通過關鍵詞或同源搜索，高效便捷找到目標基因。環藝所蘭花研究團隊已完成180多個轉錄組測序，開展重要農藝性狀關鍵基因資源挖掘［23-31］，這些基因組和轉錄組信息在NCBI 和OrchidBase等開放數據庫中都可自主下載，為現代育種學家提供便利。

近年來，基于多組學數據的分析，已在國蘭重要性狀相關基因的挖掘取得重要進展。新發現受低溫抑制的CgSVP基因可直接與AP1、SOC1、SEP蛋白互作，存在與模式植物顯著差異的花芽低溫響應機制，揭示了國蘭低溫開花調控途徑［23］。發現建蘭MADS-box基因家族中E類基因缺失和A類基因的表達區域擴張造成樹丫花型的變異，并通過不同花器官的轉錄組測序和表達譜分析，構建基于MADS-box基因的國蘭特異性唇瓣分化和重瓣化分子調控網絡［24-27］。建立了高效的墨蘭原生質體分離及瞬時表達體系，并成功運用于墨蘭開花相關基因的亞細胞定位、BiFC蛋白互作和表達調控分析［28-29］。發現葉綠體發育缺陷、葉綠素過量降解導致其體內葉綠素含量降低是墨蘭葉藝性狀的直接生理原因，CsERF2基因和乙烯信號途徑參與了墨蘭葉色變異的調控［30-31］，并采用UPLC-MS/MS為基礎的靶向（類黃酮類物質）代謝組學解析了墨蘭紅太陽葉色從紅變黃，最后變為綠色過程中代謝物的變化，發現28種代謝物的含量在葉色轉綠后下降為0，有15種花色素苷類代謝物呈現下降趨勢［32］。

2.3 新品種選育

2.3.1 選擇育種 通過野生資源的馴化篩選是蘭花育種的常用手段。1993年以來，采用選擇育種的方法培育出通過中國蘭花品種注冊登記的國蘭銘品596個（中國花卉協會蘭花分會內部資料）。國蘭在種植、分株繁殖過程中容易產生變異，如達摩墨蘭、金太陽墨蘭等，出現了20多種不同葉色的變異類型。環藝所與廣東遠東國蘭有限公司選育出通過省農作物品種審（評）定的墨蘭新品種2個、建蘭新品種3個。

2.3.2 雜交育種 雜交育種是蘭花育種中最普遍、有效的方法之一。蘭花種間甚至有些屬間雜交較容易成功，但由于蘭花種子無胚乳、胚發育不全，需依賴共生真菌才能少量萌發，早期的雜交育種非常困難，難以獲得雜種后代植株。1 854年，RHS創立了蘭花雜交種的國際登錄制度，第一個登錄的蘭花雜交種是蝦脊蘭Calanthedominyi（Cal.furcata×Cal. masuca）。Bemared［33］以眉蘭（Ophrys）的塊莖配制培養基，使卡特蘭與蕾麗亞蘭（Laelia）雜交種的種子成功萌發，開創了非共生萌發的先例。Knudson［34］發現糖類能代替真菌促進種子萌發，建立了無菌播種（胚培養）技術，蘭花新雜交種的登錄呈現爆發式增長（圖2），目前已登錄的蘭花雜交種超過14萬個，最近10年平均每年登錄的雜交種數達3 464個。

圖2 蘭花雜交種登錄趨勢Fig. 2 Trend of orchid hybrids registration in RHS

環藝所自20世紀90年代開始開展蘭花雜交育種，建立了蝴蝶蘭、大花蕙蘭、石斛蘭等蘭花的雜交育種技術，目前已在RHS上登錄蘭花雜交種99個，選育出40個蘭花新品種通過廣東省農作物品種審定，8個蘭花新品種獲得國家植物品種權證書。其中在RHS上登錄蝴蝶蘭新雜交種49個，審定蝴蝶蘭新品種23個，獲國家植物品種權證書蝴蝶蘭品種5個；在RHS上登錄蘭屬新雜交種20個，審定的大花蕙蘭新品種6個，獲國家植物品種權證書蘭屬雜交品種1個；在RHS上登錄石斛蘭新雜交種22個，審定新品種5個，獲國家植物品種權證書2個；在RHS上登錄樹蘭新雜交種1個，卡特蘭雜交種1個，萬代蘭、火焰蘭、鉆喙蘭等與蝴蝶蘭等屬間雜交種6個，蘭花雜交育種處于國內領先地位。

2.3.3 倍性育種 蘭花在減數分裂過程中容易產生2n配子，從而導致雜交后代多倍體化。蝴蝶蘭育種的超級親本Phal. Doris和Phal. Zada都是雜交產生的四倍體，在已登錄的蝴蝶蘭雜交種中，90.2%具有Phal. Doris血統，43.5%具有Phal. Zada血統［35］。我們在對引進的大花蕙蘭系譜分析以及利用大花蕙蘭與墨蘭雜交中，發現1個容易產生2n配子的親本材料，并提出了大花蕙蘭雜交多倍體化的途徑，培育出20個新雜交種在RHS上登錄，6個新品種通過省級審定。

2.3.4 體細胞無性系變異 蘭花組織培養中，通過愈傷組織或原球莖方式繁殖易產生變異，在蝴蝶蘭、大花蕙蘭、萬代蘭、兜蘭中都有報道。蝴蝶蘭屬于較易變異的種類，變異率5.6%～47.9%［36］。研究表明，具有Phal.equestris血統的中小形紅花品種以及具有Phal.pulcherrima血統的紅花品種，如Phal. Formosa Rose、Phal. King Shiang's Beauty、Phal. King Shiang's Rose 等，在組培繁殖中很容易產生三唇瓣的花型變異；斑點花、黃花、紅花等蠟質花種類也易產生變異；而大白花品種較不易產生變異。 因此體細胞無性系變異是選育蝴蝶蘭新品種的有效途徑之一。我們從小飛象蝴蝶蘭組培繁殖過程中發現一些葉色變異類型，從中選育出具大金邊的葉色變異品種金象蝴蝶蘭。

2.3.5 分子育種 分子標記輔助育種在農作物育種中得到廣泛應用，但在蘭花育種上研究報道不多，仍然缺乏與目標性狀緊密連鎖的分子標記。功能基因的育種應用是近年來蘭科植物研究的熱點方向［37-41］。目前建立的蘭科植物基因遺傳轉化技術包括基因槍法、農桿菌法、子房注射法等［37］。新加坡國立大學的于浩教授研究團隊已成功建立石斛蘭基因遺傳轉化體系，有望進行分子育種和品質定向改良［38-39］。最近利用CRISPR/Cas9基因編輯技術體系，成功獲得鐵皮石斛C3H、C4H基因點突變株系［40］和蝴蝶蘭 MADS44、MADS36、MADS8的突變株系［41］。

3 蘭花產業化技術研究

3.1 種苗繁育

種苗繁育技術一直是各類蘭花的研究重點，發表的研究論文最多。蝴蝶蘭、大花蕙蘭、石斛蘭、卡特蘭、文心蘭、竹葉蘭等熱帶蘭花，種胚以原球莖方式萌發，均已建立了成熟的高效無菌播種技術。地生種的國蘭、兜蘭，種子無菌萌發技術雖然取得較大進展，但萌發效率還有待進一步提高。

Rotor［42］于1949年首次報道了利用蝴蝶蘭花梗腋芽繁殖蝴蝶蘭的方法，花梗腋芽成為蝴蝶蘭組培快繁的常用外植體，促進了蝴蝶蘭組培苗的規模化生產。Morel［43］利用大花蕙蘭的莖尖誘導形成原球莖，培養出完整的小植株，莖尖成為大部分蘭科植物組培繁殖的主要外植體。大花蕙蘭、石斛蘭、文心蘭、卡特蘭、竹葉蘭以類原球莖方式增殖，屬易繁殖的種類；蝴蝶蘭由于類原球莖繁殖容易產生變異，生產上多采用側芽直接誘導叢生芽方式繁殖，屬中等難度繁殖的種類，繁殖系數因品種而異；國蘭和兜蘭仍屬于難繁殖的種類，前者以根狀莖方式繁殖，周期長且出苗率有待提高，后者較難誘導出類原球莖或叢生芽，除少數品種外，大部分品種的組培快繁殖技術仍有待攻克［44］。朱根發等［45］發現建蘭×紋瓣蘭雜種胚的萌發具有雜種優勢，介于大花蕙蘭與國蘭之間，萌發快且出苗率高。研究發現不同LED光質對蘭花類原球莖、根狀莖增殖，壯苗生根有顯著影響，紅藍光合理配比，可顯著提高增殖和生根效率［46-47］。蘭花在組織培養中有試管開花的現象，已在18個屬37個種（品種）中有報道［48］。

3.2 設施栽培與開花調控

經過近30年的引進、消化和創新，蝴蝶蘭的栽培技術日益完善，設施裝備更加自動化和智能化，已建立了完善的以溫度為主的開花調控技術［49-50］，實現了周年開花和應節標準化生產的目標，代表了目前設施農業的最高發展水平。大花蕙蘭（雜交蘭）、春石斛蘭和兜蘭作為盆花，文心蘭和秋石斛蘭作為切花，實現了適地適種的區域布局，實現了規模化的高效生產。墨蘭、建蘭、春蘭、春劍、蓮瓣蘭等國蘭的部分品種實現了產業化。因此，蘭花作為高產值經濟作物，是農業現代化、產業化和工廠化的典范。

3.3 病蟲害防控

危害蘭花的病蟲害種類較多，病蟲害鑒定與防控技術也是各類蘭花研究的重點，其中細菌性莖腐病、軟腐病和病毒病是蘭花生產中防控的難點。可侵染蘭花的病毒多達30 種，主要包括建蘭花葉病毒（CymMV）、齒蘭環斑病毒（ORSV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、煙草花葉病毒（TMV）、辣椒褪綠病毒（CaCV）、落葵皺紋花葉病毒（BaRMV），桿狀病毒（Rhabdovirus）、馬鈴薯Y 病毒（Potyvirus）和番茄斑萎病毒（Tospoviruses）等，且有逐年增加的趨勢［51］，通過莖尖培養培育無病毒種苗是病毒病防控的主要途徑［52］。

4 展望

蘭花具有獨特的花器官（花形），豐富的花色，多變的株型、葉形、葉色，復雜的生長習性（附生、地生、腐生），多樣的繁殖方式（根狀莖、類原球莖、叢生芽），不同的光合途徑（C3、CAM途徑）和開花特性。其假鱗莖多樣（單莖類、復莖類）、屬（種）界限不嚴、有性雜交多倍化、子房后熟、胚胎發育不全（無胚乳）、共生菌依賴、童年期長、物種瀕危、藥效成分及其作用機制等眾多問題有待開展園藝學、生物學、遺傳學、傳粉學、胚胎學、微生物學、分子生物學、生物化學、中藥學等深入研究。

蘭花是高產值的花卉，在已商品化的蘭花上，育種目標將更加多樣化，觀賞點更加多元化，在分子標記輔助、轉基因、基因編輯和分子設計育種技術取得突破的條件下，不論是國蘭還是熱帶蘭，都將更加追求幽香、葉花雙藝或多藝的育種目標。隨著數字化、信息化農業的發展，將推動蘭花資源、育種、生理、栽培、設施裝備、農業經濟的研究更加系統，蘭花產業規模將進一步擴大。

而已開發的商品化蘭花，除上述7屬外，樹蘭屬（Epidendrum）、火焰蘭屬（Renanthera）、章魚蘭屬（Prosthechea）、風蘭屬（Neofinetia）、指甲蘭屬（Aerides）、顎唇蘭屬（Maxillaria）、圍柱蘭屬（Encyclia）的部分種以及藥用的金線蓮屬（Anoectochilus）、白及屬（Bletilla）、竹葉蘭屬（Arundina）等已開發為新商品性蘭花，開始有規模化的人工繁殖和商品生產，但仍有大量的具觀賞或藥用價值的蘭科植物尚未開發，如石豆蘭屬（Bulbophyllum，1 789種）、樹蘭屬（Epidnedium，1 125種）、玉鳳花屬（Habenaria，848種）、顎唇蘭屬（Maxillaria，552種）、尾萼蘭屬（Masdevallia，507種）、羊耳蒜屬（Liparis，418種）、毛蘭屬（Eria, 404種）、蝦脊蘭屬（Calanthe，187種）、貝母蘭屬（Coelogyne，182種）、小龍蘭屬（Dracula，111種）、章魚蘭屬（Prosthechea，93種）、杓蘭屬（Cypripedium，50種）、薄葉蘭屬（Lycaste，50種）、鶴頂蘭屬（Phaius，48種）、鵝頸蘭屬（Cycnoches，33種）、劍葉文心蘭屬（Tolumnia，31種）、指甲蘭屬（Aerides，25種）、獨蒜蘭屬（Pleione，20種）、火焰蘭屬（Renanthera，17種）、埃利蘭屬（Erycina，7種）、鉆喙蘭屬 （Rhynchostylis，3種）、風蘭屬（Neofinetia，2種）等［53］，是新商品花卉開發的重要來源。