鴨坦布蘇病毒病的研究進展

黃允真 ，孫敏華 ，廖 明

（1. 廣東省農業科學院動物衛生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/農業農村部獸藥與診斷學科群廣東科學觀測實驗站，廣東 廣州 510640；2. 嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室茂名分中心，廣東 茂名 525000；3. 廣東省農業科學院，廣東 廣州 510640）

2010年春季，我國江浙地區暴發了一種以蛋鴨產蛋率急速下降為主要特點的新發動物傳染性疾病，依據其病變特點，該病被稱為鴨出血性卵巢炎（Duck Hemorrhagic Ovaritis, DHO），隨后經系統研究，確定其病原為鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu Virus, DTMUV）。DTMUV屬于黃病毒科黃病毒屬蚊媒病毒恩塔亞病毒群。黃病毒是一類重要的人獸共患病原，同屬的病原包括西尼羅病毒（West Nile virus，WNV）、登革熱病毒（Dengue virus,DENV）、黃熱病毒（Yellow fever virus, YFV）、寨卡病毒（Zika virus）、日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）等，每年可造成數百萬人感染。蚊媒傳播是許多黃病毒的主要傳播方式，而且在自然界中許多鳥類是多種黃病毒（如WNV）的擴增宿主。目前，尚未有報道表明DTMUV對人表現出致病性，但已有研究表明DTMUV可以感染人。該病毒最早于1955年在馬來西亞的庫蚊樣品中被分離鑒定［1］，但隨后鮮有對該病毒的報道。2000年，馬來西亞發現TMUV引起的以腦炎和發育遲緩為主要特征的傳染病。直到2010年，我國部分地區鴨群暴發了坦布蘇病毒病，隨后迅速擴散至全國，給我國養鴨業造成了巨大的經濟損失。之后東南亞地區相繼暴發坦布蘇病毒病。鴨坦布蘇病毒病在我國突然暴發的原因目前尚未清楚。目前已發現的TMUV毒株根據其基因組特點可分為2個譜系，分別為TMUV和DTMUV。TMUV譜系的毒株主要分離自蚊蟲。DTMUV流行至今已進化出3個群，其中1群主要在馬來西亞及泰國等東南亞地區流行，2.1亞群主要流行于中國和泰國，2.2亞群和3群主要在中國流行［2］。坦布蘇病毒病現已成為嚴重危害我國養鴨業的主要疫病之一，加之其為黃病毒屬病毒，具有潛在的人獸共患風險，因此對DTMUV進行深入研究具有重要意義。本文就近年來DTMUV的病原學、流行特點、病毒感染引起的天然免疫反應，以及疫苗研制等方面的研究進展進行綜述，以期為DTMUV的深入研究及該病的綜合防控提供借鑒。

1 病原學

DTMUV粒子呈球形，直徑約45 nm，成熟的病毒粒子外層具有含糖蛋白纖突的磷脂雙分子層囊膜。DTMUV的基因組為單股正鏈RNA，長度約為10 991個核苷酸，由5'非編碼區（UTR）、一個開放性閱讀框（ORF）和3'UTR組成。5'UTR長度為94～96個核苷酸，具有1型cap結構；3'UTR長度為618～619個核苷酸，無poly A結構。黃病毒通常以cap依賴方式進行翻譯，研究表明，DTMUV可以通過不依賴cap方式在各類易感細胞內翻譯，與依賴內部核糖體進入位點（Internal ribosome entry site，IRES）介導的翻譯機制不同，其依賴于順式作用的5'UTR和3'UTR［3］。5'UTR和3'UTR呈高度結構化，與病毒蛋白翻譯及基因組復制相關。DTMUV的ORF長度為10 278個核苷酸，編碼產生一個長為3 425個氨基酸的多肽，在宿主和病毒蛋白酶的作用下水解為3個結構蛋白（C、prM、E）和7個非結構蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）。C蛋白為核衣殼蛋白，能與病毒核酸組裝成核衣殼顆粒，可以誘導機體產生中和抗體［4］。此外，黃病毒C蛋白還與病毒的復制能力、致病性有關［5-6］。黃病毒prM蛋白在病毒的組裝、釋放中發揮重要作用。prM蛋白是M蛋白的前體，在未成熟無感染性的病毒粒子上，prM的螺旋區與E蛋白的結構域Ⅱ區相互作用形成異源二聚體，然后在蛋白酶的作用下水解為M蛋白，形成成熟的病毒粒子［7］。E蛋白是病毒的重要毒力蛋白，也是重要的免疫原性蛋白，能誘導產生中和抗體［8］。研究表明，E蛋白在介導病毒與細胞膜融合、病毒的組織嗜性、神經毒性及致病力等方面有著重要影響［9-11］。NS1屬于分泌型糖蛋白，能誘導產生非中和性抗體，與病毒的復制、組裝和感染相關［12-13］。黃病毒NS2A和NS2B相互作用形成蛋白酶復合體，主要功能是對病毒多聚蛋白進行剪切，此外還與病毒核酸的合成有關［14］。同時，DTMUV的NS2A/2B蛋白還可抑制RIG-1、MDA5-、MAVS-和STING指導的IFN-β轉錄［15］。NS3與NS2B和NS5相互作用，發揮RNA解旋酶和RNA聚合酶的作用［16］。酵母雙雜交試驗表明，NS3的HELICc結構域可以與PRDX1結合，調節p38 /絲裂原激活的蛋白激酶途徑，抑制細胞凋亡，可能有助于DTMUV逃避宿主免疫反應［17］。NS4A和NS4B在病毒復制和病毒-宿主相互作用中起多種作用，如誘導內質網重排、調節病毒復制復合物形成、調節NS3解旋酶活性和誘導宿主細胞自噬等［18］。NS5為黃病毒中最保守的非結構蛋白，含有甲基轉移酶和RNA依賴的RNA聚合酶活性，負責病毒RNA復制和RNA 5'端加cap［19］。

DTMUV可以在多種來源的細胞上傳代培養，如禽源的DEF、CEF、DF-1細胞，哺乳動物源的BHK-21、Vero、HeLa細胞，蚊源的C6/36細胞等。病毒的致細胞病變效應（CPE）取決于病毒毒株、細胞種類和培養條件。經尿囊腔接種DTMUV的雞胚或鴨胚會在2～6 d后出現死亡［20-22］。與多數有囊膜病毒一樣，DTMUV對乙醚、氯仿和過氧膽酸鹽敏感，不耐酸堿，不耐熱，56 ℃ 15 min即可滅活。

2 流行特點

2.1 宿主范圍

DTMUV具有廣泛的天然宿主，包括蚊子、鴨、雞、鵝、鴿子、麻雀等［23］。DTMUV在流行之初主要感染蛋鴨和種鴨，鴨感染后主要表現為采食量下降、拉綠色稀糞、產蛋量急劇下降等臨床特征。蛋鴨一般在感染后第2天開始表現出采食量下降，隨后在5～6 d內產蛋率可下降至10%以下，部分病鴨伴隨有神經癥狀，表現為雙腳麻痹、搖頭晃腦。該病病程約數周，蛋鴨一般可耐過，但耐過蛋鴨的產蛋性能通常無法恢復到正常水平［24］。肉鴨通常在15～35日齡發病，同樣表現為采食量下降、拉綠色稀糞、雙腳麻痹、步態不穩，通常感染后4～7 d為死亡高峰，耐過肉鴨通常表現為發育不良。剖檢病死蛋鴨可見卵巢出血性壞死、萎縮，卵泡出血、萎縮、破裂；公鴨睪丸、輸精管萎縮；部分病鴨肝臟發黃、腫大，脾臟腫大甚至破裂，也有部分鴨脾臟萎縮，心肌蒼白，有時可見條索狀壞死，多臟器漿膜表面可見紅染小體［24］。

種鵝感染DTMUV的潛伏期一般為3～5 d，主要表現為采食量下降，體溫升高，產蛋量急劇下降60%～80%，后期神經癥狀明顯，表現為共濟失調，頭頸抽搐，翅膀麻痹，步態不穩甚至癱瘓，死淘率為5%～10%，種鵝耐過后產蛋性能一般無法恢復到正常水平［25］。感染DTMUV的蛋雞表現出產蛋量下降，但通常不會死亡，臨床未發現大規模流行［26］。此外，研究人員還在發病鴨場周圍捕獲的麻雀肝臟及泄殖腔中也檢測到DTMUV［27］。

DTMUV除了有廣泛的禽類宿主外，還可感染哺乳動物。有研究人員將DTMUV通過顱內接種感染小鼠，感染后的小鼠出現嚴重神經癥狀甚至死亡［28］。此外，有研究人員還在鴨場員工的血清中檢測到DTMUV中和抗體，表明DTMUV可在鴨-人之間傳播［29］，雖未表現出致病性，但仍應引起足夠重視。

2.2 傳播途徑

大多數黃病毒屬病毒（如登革熱病毒、乙型腦炎病毒）主要通過蚊、蜱等吸血性節肢動物進行傳播。但DTMUV病的暴發沒有明顯季節性，即使在蚊蟲不活躍的秋冬季也時常發生，說明蟲媒傳播并不是DTMUV的主要傳播途徑［30］。有研究人員在山東田間的庫蚊中分離到1株TMUV，系統發育分析顯示該毒株與DTMUV同源性較高［20］。此外，已證實DTMUV可以通過庫蚊感染雞，但并不是所有種類的庫蚊都具備傳播性［31］。目前，蟲媒在DTMUV傳播中的作用有待進一步明確。

水平傳播是DTMUV在鴨群或鵝群中傳播的主要途徑，患病鴨可通過排泄物或呼出的氣溶膠傳播病毒［32-33］。研究顯示，DTMUV的E蛋白在病毒的水平傳播中起重要作用，而E蛋白第154位氨基酸糖基化的缺失可使病毒喪失水平傳播能力［11］。野生鳥類在DTMUV的跨地域傳播中可能起重要作用。事實上，因為鳥類特殊的生物學和生態學特性，其作為擴增宿主在許多黃病毒的傳播中起著重要作用，例如WNV、JEV等在傳播至人類之前就已經在鳥類宿主中得到擴增［34］。基于對麻雀感染DTMUV的研究，我們推測攜帶DTMUV的野生鳥類在遷徙過程中通過糞-口傳播途徑將病毒傳播至各處。但DTMUV具體在鴨群間如何傳播還有待進一步研究。

3 DTMUV感染的天然免疫反應研究

宿主的天然免疫反應在早期抵御病毒感染中發揮重要作用。模式識別受體（PRRs）存在于細胞的細胞膜、細胞質及內體中，包括Toll樣受體（TLR）、RIG-I樣受體（RLR）、NOD樣受體（NLR）、C型凝集素受體（CLR）和AIM2樣受體（ALR）等。它們能夠識別病原相關分子模式（PAMPs），激活免疫信號通路，誘導產生IFN-I和炎性細胞因子等，進而誘導多種干擾素刺激基因（ISGs）的表達從而發揮抗病毒作用。

3.1 PRRs介導的天然免疫反應

RLRs包 括 MDA5、LGP2和 RIG-I。RLRs存在于細胞質中，可識別RNA病毒的復制中間產物，如dsRNA或5'端三磷酸化RNA，隨后激活MAVS觸發下游信號傳導，誘導產生IFN-I和炎性細胞因子的表達［35］。而其中LGP2無法自主傳導信號，在RIG-I介導的通路中起調節作用。值得注意的是，LGP2起初被認為在通路中起負反饋調節作用，但越來越多研究表明，LGP2可在RLR信號傳導中起正反饋調節作用［36］。目前已鑒定的鴨源TLR有5種，為TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR7。其中TLR2、TLR4、TLR5主要位于細胞膜上，識別細菌、真菌等的PAMPs，TLR3識別dsRNA，TLR7識別ssRNA。激活的TRL2、TRL7募集MyD88啟動MyD88依賴的信號通路，進而激活IRF-1誘導產生IFN-I；TLR3通過募集TRIF啟動TRIF依賴的信號通路，從而激活NF-κB和IRF7，誘導產生IFN-I和炎性細胞因子的表達。

DTMUV感染1日齡櫻桃谷鴨，在感染后24、48、72 h分別分析腦和脾臟中TRL3轉錄水平的變化，結果顯示，腦組織中TRL3轉錄水平均上調，并在48 h達到高峰（13.62倍），RIG-I和MDA5分別在感染后48、72 h達到峰值（分別為4.13倍和20.60倍）；脾臟中TRL3轉錄水平在感染后24、48、72 h分別上調18.34、1.57、0.81倍，RIG-I和MDA5也分別在感染后48、72 h達到峰值（分別為13.62倍和18.77倍）。這表明RIG-I、MDA5、TLR3介導的通路在不同的感染時期發揮著協同作用［37］。體外感染研究也表明，DTMUV可上調CEF細胞或293T細胞中的MDA5、RIG-I和TLR3表達，從而誘導IFN-β、IL-28A/B、IL-29的表達。同時，一些關鍵的ISGs表達水平也顯著提高。而敲低MDA5或TLR3的細胞感染DTMUV后，IFN-β、IL-28A/B和IL-29的轉錄水平對比正常細胞顯著降低［38］。同樣，過表達MAVS可有效抑制DTMUV的復制［39］。對感染DTMUV母鴨的卵泡進行定量蛋白質組學分析結果也顯示，RLR、TLR通路參與了抗DTMUV感染過程［40］。此外，Zhang等［41］對感染DTMUV的雛鴨腦組織進行轉錄組分析，結果顯示，LGP2的轉錄水平在感染后12、24、48 h均上調，而MDA5、TLR2和TLR3轉錄水平僅在感染后24 h上調，RIG-I的轉錄水平沒有顯著變化，其中LGP2上調倍率最高。這表明了LGP2在抗DTMUV感染中可能起重要作用。LGP2在MDA5介導的抗鴨腸炎病毒（DEV）感染中起到雙向調節作用［42］，因此LGP2在抗DTMUV感染中起何種作用尚無定論，有待進一步深入研究。值得注意的是，Zhang等［41］的研究中，病毒感染并未改變鴨腦組織中RIG-I的轉錄水平，這與其他已發表的研究結果存在差異，可能與鴨品種和毒株有關，其內在機制有待進一步研究。除了RLR和TLR介導的信號通路，NLR、CLR、HMGB、DDX3X 等介導的信號通路同樣參與了DTMUV的感染過程［41,43-45］，但具體調控機制仍有待進一步確認。

3.2 ISGs抗DTMUV感染的研究

Zhang等［41］在對感染DT M UV的雛鴨腦組織轉錄組分析時發現，至少有22個ISGs存在轉錄 上 調， 其 中 IFIT5、Mx、OASL、VIPERIN和ZC3HAV1已被證實在哺乳動物細胞中發揮抗病毒作用［46］。而IFIT5、OASL、VIPERIN轉錄水平至少在感染后12、24、48 h其中一個時間點上調了200倍以上。IFIT5是一種干擾素誘導蛋白，過表達IFIT5的細胞在感染后24 h，DTMUV滴度顯著降低，但感染后48 h的病毒滴度顯著增加，而敲低IFIT5則得到相反的結果。進一步研究發現，過表達IFIT5可顯著抑制NF-κB和IRF7以及下游IFN誘導干擾素刺激的反應元件（ISRE）啟動子的激活，同時抗病毒蛋白Mx的轉錄水平明顯下調［47］。Mx是一種抗粘液病毒蛋白，敲低或過表達該蛋白影響DTMUV的復制［48］。OASL蛋白屬于OAS蛋白家族，在許多病毒感染過程中顯示出廣泛的抗病毒能力［49］。有研究克隆了櫻桃谷鴨的OASL蛋白，體外研究表明，在DF-1細胞中鴨OASL過表達會輕微抑制DTMUV復制，而敲低鴨OASL會增加細胞中DTMUV復制［50］。VIPERIN是一種自由基S-腺苷甲硫氨酸（SAM）酶，在抗病毒反應中發揮多方面作用［51］。鴨VIPERIN已被證實可抑制BHK-21細胞和DEF細胞中DTMUV的出芽［52-53］。IFITM1和IFITM3的過表達也能抑制DF-1細胞中DTMUV的復制［54］。此外，轉錄組分析還發現多種ISGs參與了DTMUV感染過程，其中一些基因已被證實在其他黃病毒感染中發揮著重要的抗病毒作用［43,55］，但是這些ISGs在抗DTMUV中的具體作用還有待進一步研究。

3.3 免疫逃逸

盡管DTMUV感染可激活PRRs介導的免疫通路，但在一些感染研究中，DTMUV可以分別在轉錄和翻譯水平上抑制IFN-I的表達［56］。DTMUV感染DEF細胞會下調miR-148a-5p的產生，從而上調SOCS1的表達，進而抑制IFN-I的產生并促進病毒復制［57］。同時還會上調miR-221-3p的產生，導致SOCS5表達下調，抑制IFN-β的表達從而促進病毒復制［58］。自噬也是黃病毒逃逸宿主免疫反應的重要途徑，DTMUV感染鴨可引起各組織中的細胞自噬，使用自噬抑制劑可抑制DTMUV復制并減輕DTMUV引起的病理癥狀，而自噬誘導劑的治療則產生相反作用。同時，自噬還會影響PRRs、IFN-I及其他細胞因子的表達。表明自噬促進了DTMUV復制，加劇了病理癥狀的發展，并可能抑制宿主體內的天然免疫應答［59］。以DEF細胞為模型，發現DTMUV感染可以增加LC3-II的表達，而多聚泛素結合蛋白螯合體1（p62）表達下調，證實了DEF細胞中發生了完全自噬，并且自噬抑制NF-κB和IRF7的激活，增強了DTMUV復制［60］。DTMUV利用多種機制拮抗宿主細胞機制以促進復制，病毒復制依賴于宿主內質網（ER），并誘導產生ER應激，從而導致細胞未折疊蛋白應答（UPR）的激活。已有研究表明，黃病毒可通過UPR減輕由病毒蛋白積累引起的ER應激，并使ER擴增，避免細胞凋亡，從而有利于病毒復制［61］。

4 DTMUV疫苗研制

4.1 弱毒疫苗

DTMUV可在多種細胞及胚體上傳代培養，因此該病毒的致弱手段多種多樣。Li等［62］將臨床分離株FX2010在CEF細胞上連續傳代180代，獲得FX2010-180P弱毒株，研究證明，該弱毒株免疫原性優良，安全性可靠，目前已開發為成熟的商品化疫苗，并在生產中取得了良好效果［62］。此外，研究人員還在雞胚、鴨胚、DF-1、BHK-21等生物材料上成功獲得了多株免疫原性良好、安全性高的減毒疫苗候選毒株［63-65］。目前，已經培育多株候選疫苗株，而如何在保證免疫原性和安全性的基礎上提高弱毒株的效價、降低生產成本是后續弱毒疫苗研究的重點。

4.2 滅活疫苗

相較于弱毒疫苗，滅活疫苗在安全性上更有保障。目前商品化的DTMUV滅活疫苗有HB株滅活疫苗，并且同樣廣泛應用于臨床生產中［66］。但滅活疫苗免疫原性低于弱毒疫苗，往往需要多次免疫才能達到令人滿意的效果。研究人員用β-丙內酯作為滅活劑制備DTMUV滅活疫苗，發現相比甲醛滅活，該疫苗的免疫效力更高［67］。佐劑的使用是增強疫苗免疫效力的重要手段，例如將滅活疫苗與CpG ODNs佐劑聯用，免疫保護試驗結果表明，CpG ODNs佐劑可顯著提高機體血清血凝抑制（HI）抗體滴度、DTMUV抗體的陽性率、血清細胞因子濃度和保護效力［68］。此外，張聰等［69］評估了重組融合肽Tα1-BP5對DTMUV滅活疫苗的免疫增強作用，結果表明，rTα1-BP5能顯著增強機體的細胞和體液免疫應答水平。雖然佐劑的使用可以有效提高DTMUV滅活疫苗的免疫效力，但也意味著疫苗成本增加，在實際臨床使用中難以推廣。因此，滅活疫苗的研究應以選育免疫原性強、培養效價高的毒株為主。

4.3 基因工程疫苗

在DTMUV疫苗研究中，DNA疫苗是研究的一個重要方向。將DTMUV的prM/E基因克隆至pVAX1載體，同時在載體中引入用以提高免疫效力的CpG基序，構建重組質粒pVAX1-prM/E-CpG。免疫保護試驗結果表明，pVAX1-prM/E-CpG可有效誘導機體產生體液免疫和細胞免疫，攻毒保護率可達100%［70］。有研究將DTMUV的C基因克隆至pVAX1載體，構建重組質粒pVAX1-C，經口服免疫后，可誘導機體產生體液和細胞免疫反應，且能有效保護機體免受強毒攻擊；進一步利用沙門氏菌SL7207株為載體口服遞送pVAX1-C，同樣可為機體提供良好的免疫保護，該方法經濟有效，具有大規模臨床應用前景［4］。

嵌合疫苗是一種通過改造病原體并構建表達多種病原抗原的載體而制備成的疫苗。廣東省農業科學院動物衛生研究所以新城疫病毒（NDV）GM株為載體構建表達DTMUVprM/E基因的嵌合病毒aGM/prM+E，動物免疫試驗結果表明，aGM/prM+E能針對NDV和DTMUV強毒的攻擊提供有效保護［71］。以鴨腸炎病毒（D EV）為載體，利用CRISPR/Cas9構建同時表達H5N1禽流感病毒（AIV）HA基因和DTMUVprM/E基因的重組DEV（C-KCE-HA/PrM-E），動物免疫試驗結果表明，單劑量的C-KCE-HA/PrM-E即可使鴨抵抗H5N1、DTMUV和DEV攻擊［72］。此外，該單位還利用桿狀病毒表達系統，設計并制備了表面展示DTMUV E蛋白和H3N2 HA2蛋白的重組嵌合AIV VLPs（VLPs E-HA），試驗證實其具有良好的免疫原性［73］。腺病毒載體是目前應用最廣泛的疫苗載體之一，研究人員構建了表達DTMUV E蛋白的重組腺病毒rAd-E，免疫攻毒試驗顯示，rAd-E雖不能為鴨提供100%的免疫保護，但存活率高于對照組，這可能與免疫次數和劑量有關［74］。不同種類的疫苗聯合使用有助于免疫效果的提升，利用表達prM-E或E的減毒沙門活疫苗和重組腺病毒載體疫苗進行異源初免—加強免疫，其免疫效果強于同源初免—加強免疫［75］。

此外，亞單位疫苗也是DTMUV疫苗研究的熱點。E蛋白是DTMUV的主要抗原蛋白，DTMUV亞單位疫苗的研究也主要圍繞E蛋白展開。目前研究已證實，E蛋白結構域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ均能有效誘導小鼠產生 DTMUV 中和抗體［76-77］。Li等［78］用桿狀病毒表達系統表達截短的E蛋白，免疫攻毒試驗證明，截短的E蛋白能為鴨提供100%的免疫保護。為提高亞單位疫苗的免疫原性，研究人員將原核表達并純化的E蛋白與脂質體混合制備成亞單位疫苗，免疫試驗結果表明，該亞單位疫苗能誘導產生更高水平的特異性抗體［79］。此外，目前已鑒定出了多個E蛋白B細胞表位，并證實了這些表位具有良好的免疫原性，為表位疫苗的研發提供基礎［80］。盡管DTMUV亞單位疫苗的研究取得了一定進展，但免疫原性和生產成本依然制約著DTMUV亞單位疫苗的臨床使用。

5 展望

鴨坦布蘇病毒病自暴發以來，對我國及東南亞地區養鴨業造成了巨大的經濟損失。該病的防控以預防為主，目前商品化的疫苗包括WF100株弱毒疫苗、FX2010-180P株弱毒疫苗、HB株滅活疫苗。其中弱毒疫苗的安全性一直備受關注，但目前臨床使用的商品弱毒疫苗還未發現有明顯副作用，也沒有出現毒力返強現象。與弱毒疫苗相比，滅活疫苗安全性上更加可靠，但存在免疫程序繁瑣、保護率稍低等缺點。因此更加高效、安全、廉價的DTMUV疫苗的研發是今后疫苗研究工作的重點。目前，對DTMUV感染后宿主體內免疫反應分子機制的研究還不夠深入。隨著鴨全基因組測序的完成以及免疫相關基因注釋的完善，今后可聯合多組學分析和分子生物學手段，深入研究DTMUV與宿主的互作，闡明疾病的發生過程與免疫反應機理，為靶向治療藥物開發及新型疫苗的研制提供理論基礎。