珍珠舌草膠囊全方對胃癌細胞增殖與凋亡的影響及機制研究*

譚 寶，張 潔，馮五金，高麗萍，智雪峰，蘇娟萍△

（1.山西省中醫院，山西 太原 030000；2.山西醫科大學第二醫院，山西 太原 030000；3.山西中醫藥大學，山西 太原 030000）

胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤，全球每年新增確診病例約 93.4萬，位居所有惡性腫瘤的第2位[1]。胃癌是全球公認的高發病率的癌變疾病，雖然全球胃癌的發病率在下降，然而亞洲國家的胃癌致死率卻仍在上升[2]，胃癌也是我國的高發疾病。研發高效、低毒的化療新藥和新的治療方案對胃癌的治療具有重要意義。

課題組根據傳統中醫理論及多年臨床經驗，研制出珍珠舌草膠囊，其由黃芪、枳實、白術、木香、砂仁、丹參、莪術、珍珠層粉、蒲公英、白花蛇舌草等組成，用于治療胃癌前病變。經臨床反復驗證，累計治療慢性萎縮性胃炎（CAG）患者近萬例，發現其在改善慢性萎縮性胃炎臨床癥狀，降低胃黏膜慢性炎癥、腸上皮化生、異型增生、Hp感染等方面作用顯著[3-7]。慢性萎縮性胃炎伴癌前病變和胃癌關系密切，查閱文獻發現，慢性萎縮性胃炎伴癌前病變和胃癌的病因病機、治療方法有許多相同之處[8-10]。

珍珠舌草膠囊全方能有效治療胃癌前病變，對胃癌可能有一定治療效果，因此認為有必要針對珍珠舌草膠囊的抗腫瘤作用進行研究。珍珠舌草膠囊中的組成中藥具有增強免疫力及抗腫瘤活性，應用珍珠舌草膠囊抗腫瘤研究具有現代藥理學理論基礎[11-14]。故本研究在珍珠舌草膠囊有效治療慢性萎縮性胃炎伴癌前病變基礎上，進一步探討其抗腫瘤作用，以期為其臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞、試劑與儀器 AGS細胞株購于中國科學院細胞庫。Ham’s/F-12培養液購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司；胎牛血清（FBS）購于杭州四季青生物工程有限公司；DMSO（二甲基亞楓）和RNase A（核糖核酸酶A）購于金科宏達生物公司；MTT購于上海日初生物科技有限公司；PI（propidium iodide，碘化丙啶）購于美國Sigma公司；胰酶購于美國Invitrogen公司；33342/PI試劑盒購于中國Beyotime公司；Annexin V購于美國 BioVision公司；SpectraMAX 190微孔讀板機購于美國分子儀器公司（MD，USA）；FACScan流式細胞儀購于美國BD公司（Becton Dickinson，USA）；ModFitLT V3.0 軟件和熒光顯微鏡購于日本Olympus公司。

1.2 藥物制備 珍珠舌草膠囊由黃芪、枳實、白術、木香、砂仁、丹參、莪術、珍珠層粉、蒲公英、白花蛇舌草等組成，藥物由山西省中醫藥研究院中藥房提供，生藥鑒定由本研究中心完成并提供詳實的鑒定報告。取珍珠舌草膠囊復方飲片1帖，加入8倍量95%乙醇浸泡12 h，武火煮沸后改用文火保持微沸2 h，過濾，濾渣重新加入約8倍95%乙醇，繼續加熱，重復提取2次，合并濾液，轉移濾液至旋轉蒸發儀，回收乙醇至不再蒸出，將提取物水浴揮干水分后轉移至真空干燥箱減壓低溫干燥。待干燥后用研缽研成細粉備用。

1.3 胃癌AGS細胞培養 AGS細胞培養在含10%FBS、1%雙抗的Ham’s/F12完全培養基中，置于37℃、5% CO2培養箱中培養。視培養液顏色和細胞生長狀況決定是否換液，當細胞貼壁達80%左右，用0.25%胰酶溶液消化傳代。

1.4 細胞活力檢測 AGS細胞以1.0×104個/mL接種于96孔板內，每孔200 μL，貼壁24 h后，換上含藥培養基，以含DMSO培養基做陰性對照，珍珠舌草膠囊藥物濃度為0.25、0.5、1.0 mg/mL，干預細胞生長24、48 h，然后加入 20 μL 5 mg/mL MTT 溶液，繼續孵育4 h，去除含MTT的培養液，加入150 μL DMSO，振蕩 15 min，570 nm 處測定吸光值（OD），根據公式（藥物組/對照組OD值）*100%計算細胞活力。

1.5 細胞周期檢測 AGS細胞以2.5×104個/mL接種于6孔培養板，每孔3 mL，過夜待細胞貼壁后，將培養液換成不含血清的培養基，饑餓以同步，繼續培養24 h后，換上不同濃度的含藥培養基，珍珠舌草膠囊藥物濃度為0.25、0.5、1.0 mg/mL，細胞分別培養24、48 h，0.25%的胰酶消化細胞，用預冷的PBS終止消化，吹打細胞，移入離心管中。棄上清，冷PBS洗2次，離心去PBS，加入1 mL PBS重懸細胞，加入預冷的無水乙醇固定，4℃，6 h以上。1 000 r/min離心5 min棄去固定液，2 mL冷PBS洗2次，離心后棄上清。4℃，PI染液染色，避光孵育30 min，流式細胞儀檢測。

1.6 細胞凋亡檢測 AGS細胞以2.5×104個/mL接種于6孔培養板，每孔3 mL，貼壁24 h后，將培養液換成不含血清的培養基，饑餓以同步，繼續培養24 h后，換上不同濃度的含藥培養基，珍珠舌草膠囊藥物濃度為 0.25、0.5、1.0 mg/mL，細胞培養 24、48 h，到作用時間后，收集細胞上清，加0.125%胰酶消化細胞，37℃約1 min，加細胞培養液終止消化，輕柔吹打細胞，并收集細胞與上清一起，切忌損傷細胞。冰冷PBS（4 mL）中離心，300×g，5 min，棄上清，旋渦振蕩器點動分散細胞后，加入4 mL Annexin V結合緩沖液再次洗滌細胞，棄上清。加入500 μL Annexin V結合緩沖液重懸細胞，隨后加入FITC標記的Annexin V 1 μL（終濃度 1 μg/mL），再次點動混勻，隨后冰浴 30 min，中間取出再混勻一次。染色結束后，加入4 mL Annexin V結合緩沖液洗滌細胞，棄上清，加入500 μL Annexin V結合緩沖液重懸細胞，置于冰浴中保存。上機前加入PI（終濃度5 μg/mL），并立即上機檢測。

1.7 Caspase-3活性檢測 AGS細胞以2.5×104個/mL接種于6孔培養板，每孔3 mL，貼壁過夜，換上不同濃度的含藥培養基，珍珠舌草膠囊藥物濃度為0.25、0.5 mg/mL，細胞培養 24、48 h，0.25%胰酶消化，細胞數需達 1～5×106個，1 500 r/min，離心 5 min，懸浮細胞于50 μL冰冷細胞裂解液中裂解10 min，10 000×g離心1 min，收集上清，冰上放置，然后進行蛋白濃度測定，將50～200 μg蛋白用細胞裂解液補充至50 μL，加入 50 μL 的 2×反應緩沖液（含 10 mM DTT），加入5 μL 4 mM 的 DEVD-pNA（200 μM 終濃度），37 °C孵育1～2 h，405 nm處測定吸光值（OD）。

2 結果

2.1 珍珠舌草膠囊全方對AGS細胞活力的影響珍珠舌草膠囊干預胃癌細胞后，通過顯微鏡下觀察，細胞數量明顯減少，形態學也發生一定變化，部分細胞發生脫落、變圓，細胞壁邊緣毛糙。從MTT結果可見，珍珠舌草膠囊干預胃癌細胞24、48 h，能呈劑量和時間依賴性的抑制AGS細胞生長。與DMSO對照組相比，0.25、0.5、1.0 mg/mL的珍珠舌草膠囊干預細胞24 h，可使AGS細胞活力從69.5%下降至14.5%；干預細胞48 h，可使AGS細胞活力從53.4%下降至9.26%，差異有統計學意義（P<0.01），見圖1。

圖1 珍珠舌草膠囊全方對AGS細胞活力的影響

2.2 珍珠舌草膠囊全方對AGS細胞周期的影響為了探討珍珠舌草膠囊全方抑制胃癌細胞增殖的可能機制，檢測了其干預胃癌細胞24、48 h后細胞周期的變化。結果表明，珍珠舌草膠囊全方能阻滯胃癌細胞周期于G2/M期，能顯著增加處于G2/M期的細胞數，細胞數從16.29%上升至29.02%，而干預胃癌細胞 48 h，G2/M期的細胞數從 21.15%增加到37.67%。表明珍珠舌草膠囊全方干預細胞24、48 h均能阻滯胃癌細胞周期于G2/M期，見圖2、圖3。

2.3 珍珠舌草膠囊全方對AGS細胞凋亡的影響 細胞凋亡檢測結果表明，珍珠舌草膠囊全方0.25、0.5、1.0 mg/mL干預胃癌細胞24 h后，早期凋亡率分別為3.4%、10.0%、16.1%，干預48 h后，早期凋亡率分別為5.4%、11.3%、20.2%，提示珍珠舌草膠囊全方促細胞凋亡有時間和劑量依賴性，與對照組相比，0.5、1.0 mg/mL組差異具有統計學意義（P<0.01），見圖 4、圖 5。

2.4 珍珠舌草膠囊全方對Caspase-3活性的影響 珍珠舌草膠囊全方干預AGS細胞24 h，0.25、0.5 mg/mL組Caspase-3的活性分別是對照組的2.56倍和3.69倍，干預48 h后，是對照組的2.73倍和7.32倍。提示珍珠舌草膠囊全方能呈時間和劑量依賴性地增加Caspase-3的活性，與對照組比較，差異具有統計學意義（P<0.01），見圖 6。

圖2 珍珠舌草膠囊全方對胃癌細胞周期的影響（24 h）

圖3 珍珠舌草膠囊對胃癌細胞周期的影響（48 h）

圖4 珍珠舌草膠囊全方醇提物對胃癌細胞早期凋亡的影響（24 h）

圖5 珍珠舌草膠囊全方醇提物對胃癌細胞細胞凋亡的影響（48 h）

圖6 珍珠舌草膠囊對Caspase-3活性的影響

3 討論

本研究結果表明，珍珠舌草膠囊能夠抑制胃癌細胞生長，阻滯胃癌細胞周期于G2/M期，促進細胞凋亡，明顯增強Caspase-3的活性。細胞增殖與凋亡的平衡對于保持胃腸粘膜的完整性具有重要意義[15-16]。一旦這種平衡被破壞，就會誘發慢性萎縮性胃炎或胃癌前病變甚至是腫瘤。慢性萎縮性胃炎伴癌前病變是胃癌的重要誘發因素，因為重癥胃炎破壞了胃粘膜的上皮細胞，最終正常的胃粘膜上皮細胞被具有較高增殖率的腸上皮細胞和異型增生細胞取代，導致了慢性腸化生和異型增生的出現。腸化生和異型增生打破了正常胃粘膜細胞增殖與凋亡的平衡，增加了胃癌的發生機率[17]。目前缺乏治療胃癌伴癌前病變的有效藥物，而中醫藥治療該病取得了較好的臨床效果。

珍珠舌草膠囊為臨床經驗方，可以有效治療慢性萎縮性胃炎伴癌前病變，對胃癌前病變細胞的增殖有良好的阻斷作用。周期阻滯和誘導凋亡是抑制細胞生長的兩個重要因素[18-19]。死亡受體和線粒體依賴途徑是細胞凋亡的主要途徑[20]。Caspase-3是這兩條途徑的一個主要環節，因此它在細胞凋亡中起到非常重要的作用。細胞凋亡是在基因控制下的細胞自我消亡過程，腫瘤的形成一方面是增殖分化異常，分化不良增殖過度，另一方面是誘導凋亡的基因突變，抑制凋亡的基因過度表達使得凋亡不足[21]。珍珠舌草膠囊全方干預AGS細胞24、48 h后，Caspase-3的活性均明顯升高，并且作用呈現出一定的時間和劑量依賴性。提示珍珠舌草膠囊促進AGS細胞凋亡，可能與其增強了Caspase-3的活性有關。

分析以上結果可知，珍珠舌草膠囊全方能夠抑制ACS細胞生長，其抑制細胞增殖的作用可能與阻滯細胞周期，促進胃癌細胞凋亡有關，而促凋亡作用可能通過升高Caspase-3的活性實現。上述結果說明，珍珠舌草膠囊在體外實驗中具有一定的抗腫瘤活性，下一步將進行拆方研究，進一步明確抗腫瘤有效成分，為臨床更好地應用珍珠舌草膠囊提供理論和實驗依據。