RANKL基因多態性與動脈粥樣硬化性腦梗死發病的相關性

范 雪 趙冬雪

1.遼寧省健康產業集團本鋼總醫院神經內科，遼寧本溪 117000；2.中國醫科大學附屬盛京醫院神經內科，遼寧沈陽 110000

動脈粥樣硬化性腦梗死是嚴重危害人類健康的全球性疾病，然而目前各類人群的發病風險仍然無法準確預測[1]。動脈粥樣硬化性腦梗死表現出很強的遺傳易感性，不同基因型人群對該病的易感性不同。我們通過篩查該病的易感基因，可對易感人群進行早期預警。核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL） 基因rs9533156 位點多態性與動脈粥樣硬化性腦梗死的關系在國內人群中尚未開展過研究，本研究旨在探討RANKL 基因rs9533156 位點多態性與動脈粥樣硬化性腦梗死發病的相關性。RANKL 是腫瘤壞死因子 （tumor necrosis factor，TNF）超家族重要的成員之一。RANKL 基因屬于Ⅱ型跨膜蛋白，人RANKL 基因位于染色體13q14，是破骨細胞分化和活化的重要細胞因子，表達于成骨細胞或基質細胞表面[2]。RANKL 能刺激趨化因子釋放、單核巨噬細胞基質遷移和基質金屬蛋白酶活性，在動脈粥樣硬化中起著重要作用[3]。Biscetti 等[4]研究發現在意大利人群中RANKL 基因rs9533156 多態性顯著（55.0%比36.5%，P＜0.0001），與缺血性腦卒中的發病獨立相關，RANKL 的遺傳變異是缺血性腦卒中獨立風險因素。由此推斷RANKL 基因rs9533156 多態性與中國遼寧漢族人群腦梗死的易感性也可能相關。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年3月～2018年7月就診于中國醫科大學附屬盛京醫院神經內科診斷為動脈粥樣硬化性腦梗死的213 例患者作為病例組，男142 例，女71例，年齡45～70 歲。納入標準：①符合第四屆全國腦血管病學術會議制定的診斷標準及改良TOAST 分型標準[5]（因發病機制的不同，選擇發病率最高的大動脈粥樣硬化型進行研究）；②影像學檢查[頭磁共振成像（MRI）+磁共振血管造影(MRA)、頸部血管彩超]支持以上診斷。排除標準：①伴腦出血的腦梗死者；②小動脈閉塞型腦梗死者；③心源性腦栓塞者；④血管畸形或動脈炎所致的腦梗死者；⑤有嚴重心、肝、腎功能不全者；⑥腫瘤、自身免疫性疾病者。選取同期同醫院體檢中心的健康體檢者197 例作為對照組，男112 例，女85例，年齡45～70歲，排除標準同病例組。入選對象均為遼寧漢族人，彼此間無親緣關系，簽署知情同意書后進行血樣采集，均符合盛京醫院倫理委員會制定的倫理學標準。

1.2 方法

所有入選者空腹抽取靜脈血2 ml 加入EDTA-2K 抗凝管中，使用天根血液DNA 提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）按說明書的步驟提取，提取出的DNA 采用PCR 技術進行目的基因片段的擴增，再應用改良多重連接酶反應技術對rs9533156 位點進行基因分型。PCR 及連接引物由上海天昊生物有限公司設計（表1）。連接產物上ABI3730XL 測序儀（北京龍躍生物科技發展有限公司），測序儀上收集的原始數據采用GeneMapper 4.1（Applied Biosystems，USA）軟件進行分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0 統計學軟件進行數據分析。用卡方檢驗進行Hardy-Weinberg 平衡分析，明確樣本是否具有群體代表性。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗。計數資料的組間比較采用χ2檢驗。采用Logistic 回歸分析研究基因型與動脈粥樣硬化性腦梗死的相關性，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組基因型分布及等位基因頻率

病例組和對照組的SNP 位點均滿足Hardy-Weinberg 平衡（χ2=1.371，P=0.242），說明該樣本具有良好的群體代表性。RANKL 基因rs9533156 位點的三種基因型為TT、CT、CC。以TT 為參照，CT 和CC 基因型在病例組和對照組中的Logistic 分析結果差異無統計學意義（P＞0.05）。以等位基因T 為參照，等位基因C 在病例組和對照組中的Logistic 分析結果差異無統計學意義（P＞0.05）（見表2）。

2.2 兩組顯性模型和隱性模型RANKL-rs9533156 基因型的比較

顯性模型和隱性模型分析顯示，兩組RANKLrs9533156 基因型比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表3）。

表1 RANKL-rs9533156 PCR 引物及連接引物

表2 兩組RANKL-rs9533156 基因型分布及等位基因頻率的比較[n（%）]

表3 兩組顯性模型和隱性模型RANKL-rs9533156 基因型的比較

3 討論

多種類型的細胞都可表達RANKL，例如破骨細胞、活化的T/B 細胞、骨髓基質細胞、乳腺上皮細胞等[6]。研究表明[7]，RANKL 對骨重建、乳腺發育、T/B 細胞的早期分化、淋巴結形成、體溫調節等重要生理過程發揮調節作用，同時還參與了乳腺癌的發生、腫瘤骨轉移、骨質疏松、關節炎等病理過程。Sassi 等[8]研究發現在絕經后的突尼斯婦女中，RANKL 基因-643C/T的多態性與骨質疏松的風險具有相關性。Yang 等[9]研究發現RANKL 基因rs2277438 多態性增加了類風濕性關節炎的發病風險。Petean 等[10]研究發現RANKL基因rs9594738 多態性與持續性根尖周炎發病顯著相關。Shaker 等[11]研究發現RANKL 基因多態性與乳腺癌的發病風險及預后密切相關。Mrozikiewicz-Rakowska 等[12]研究發現RANKL 基因rs9533156 多態性與糖尿病足的發病相關。SaiPrathiba 等[13]研究發現RANKL 基因-643C/T 與2 型糖尿病合并神經病變單獨顯著相關。Wang 等[14]研究發現RANKL 基因單倍型rs7984870C/rs9533155G/rs9525641C 與強直性脊柱炎敏感性呈負相關。Biscetti 等[4]已經證實在意大利人群中RANKL 基因rs9533156 多態性與缺血性腦卒中發病顯著相關。

本研究結果顯示：在中國遼寧漢族人群中RANKL 基因rs9533156 多態性與動脈粥樣硬化性腦梗死的發病無相關性。得出的結論不同首先可能是因為基因多態性與疾病的關系在不同種族中存在著差異。意大利人群屬于歐洲白種人，遼寧漢族人群屬于亞洲黃種人，基因多態性本身存在種族和地域的差異性，研究得出的結論可以不同。例如路甲鵬等[15]研究發現，歐洲西部和北部后裔、中國北京漢族人、日本東京人，尼日利亞的約巴魯人4 個種群中，鹽敏感性高血壓易感基因多態性的分布有著顯著差異。其次本研究為單中心病例對照研究，樣本量相對較小，結果可能出現偏倚。應繼續收集樣本，多中心跨地域收集，以便做進一步的研究，反復驗證結論的準確性。