慢性高尿酸血癥腎病模型大鼠尿液和腎臟的代謝組學研究

邵曉妮，吳美薇，黑亞南，孫英凱

(西南民族大學藥學院，四川 成都 610041)

流行病學研究表明，高尿酸血癥已成為危害工業化國家健康的主要問題，其患病率在全世界范圍內逐年升高[1]。近年來，有研究通過縱向觀察和介入研究提出，高尿酸血癥與慢性腎病之間的關系，并提示血清尿酸水平與腎功能損傷的發生和發展具有密切相關性[2]。組織病理學研究顯示，79%～99%的高尿酸血癥患者都伴有腎臟損傷[3]。因此，防治高尿酸血癥慢性腎病具有十分重要的意義。

高尿酸血癥誘導慢性腎病的發病機制十分復雜，且有多種途徑，如激活白細胞介素( interleukin，IL)-6 ，信號傳導與轉錄激活因子3和活性氧簇[4]。在腎臟中，尿酸能在人腎近端管狀上皮細胞中誘導單核細胞趨化蛋白1的產生[5]和激活絲裂原活化蛋白激酶信號通路[6]。尿酸還可激活NOD樣受體蛋白3，并刺激分泌IL-1β和IL-18。而IL-1β和IL-18的激活也是導致腎功能損傷的原因之一[7]。盡管很多致病因素已經被發現，但高尿酸血癥誘發慢性腎病的機制仍然需要深入研究。

代謝組學是繼基因組學、蛋白質組學和轉錄組學之后的一門新興學科，主要用于發現生物體整體代謝變化，揭示機體生命活動的代謝本質，通常被用作醫學領域的研究，包括疾病診斷、生物標志物篩查，以及化學物質安全性評估[8]。

本文利用1H-NMR技術研究慢性高尿酸血癥腎病模型大鼠尿液和腎組織中的代謝特征，鑒定其差異代謝物和代謝通路。旨在為高尿酸血癥所致慢性腎病的臨床診斷和治療提供潛在生物標志物，并為進一步機制研究奠定堅實理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SPF級Wistar大鼠16只，♂，體質量(200±20)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京) 2016-0006。飼養溫度(22 ±2) ℃，濕度(55±5)%，噪音<85 dB，提供12 h/12 h白天和黑夜循環照明，自由飲食飲水。將大鼠分為兩組，對照組飼喂正常基礎飼料，高尿酸血癥組飼喂2%尿酸和2%氧嗪酸鉀的高尿酸復合飼料，連續飼喂12周，本實驗所有動物操作均嚴格按照西南民族大學動物保護和使用規定。

1.1.2主要試劑 尿酸(uric acid)、氧嗪酸鉀(oxonic acid)(南京康滿林化工實業有限公司)；血清尿酸(serum uric acid，SUA)、血清葡萄糖(serum glucose，GLU)、血清尿素氮( blood urea nitrogen，BUN) 、血清肌酐(serum creatinine，CREA)血生化試劑盒(四川邁克生物科技股份有限公司)；氘水(D2O)(美國Sigma公司)。

1.1.3儀器 DP80顯微鏡( 日本Olympus公司)；石蠟組織包埋機( 德國Leica公司) ；石蠟組織冷凍機( 德國Leica公司) ；病理切片機( 德國Leica公司) ；PHY-Ⅲ病理組織漂烘處理儀( 常州中威電子儀器廠) ；高速低溫離心機( 德國Heraeus sepatech公司) ；7020全自動血生化儀( 日本Hitachi公司) ；Bruker 600 MHz AVANCE Ⅱ NMR ( 德國Bruker公司)。

1.2 血清生化指標水平檢測10%水合氯醛腹腔注射麻醉慢性高尿酸血癥腎病模型大鼠，抽取腹主動脈血，經凝固(4 ℃, 60 min)后離心(3 000 r·min-1, 15 min, 4 ℃)得到血清。SUA、GLU、BUN和CREA測定嚴格按照血生化試劑盒說明書操作。

1.3 腎臟組織病理學觀察取大鼠腎臟，固定于4%多聚甲醛中，梯度乙醇脫水，石蠟包埋。將蠟塊切成4 μm厚切片，經HE染色，然后用DP80顯微鏡進行腎臟組織病理學觀察。

1.4 代謝組學檢測及分析

1.4.1尿液采集和預處理 將大鼠尿液樣本收集到含有1%疊氮化鈉容器中低溫放置過夜。離心(3 500 r·min-1, 15 min, 4 ℃)，除去沉淀，收集上清液。為了盡量減少尿液pH差異所引起的化學位移變化，將400 μL尿液與200 μL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1Na2HPO4-0.2 mol·L-1NaH2PO4, pH 7.4) 混合，將混懸液靜置20 min后離心(12 000 r·min-1, 10 min, 4 ℃)。然后將500 μL上清液與50 μL D2O(含有0.05%W/VTSP-d4) 加入5 mm NMR管中，振蕩混勻，待測。

1.4.2腎臟提取和預處理 大鼠在取樣前應禁食過夜，且所有的樣本均保存在-80 ℃，待分析時取用。將腎組織樣品稱重，冰水浴中用50%氯仿-水溶液勻漿( 5 mL·g-1腎組織) ，離心(12 000 r·min-1, 10 min, 4 ℃)。將混懸液靜置冰上30 min。取上清，40 ℃氮氣吹干。加入580 μL含有磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1Na2HPO4-0.2 mol·L-1NaH2PO4, pH 7.4)和D2O(含有0.05%W/VTSP-d4)中，離心(12 000 r·min-1, 10 min, 4 ℃)，取550 μL上清液轉移到5 mm NMR管中，振蕩混勻，待測[8]。

1.4.31H-NMR測定 所有尿液和腎組織樣品均在600.13 MHz的核磁共振氫譜下檢測，實驗溫度為26.85 ℃，寬度為12 335.5 Hz，采集時間為2.66 s，弛豫延遲時間為7.66 s，掃采樣點數64 K；采集次數128次。

1.4.41H-NMR圖譜處理及多變量數據分析 所有1H-NMR光譜用MestReNova-6.1-6384軟件(西班牙Mestrelab Research公司)對相位和畸變基線進行校正。經過相位的調整和基線的校正后，尿液的譜圖以加入的TSP-d4( δ 0.00) 為標準，對譜圖進行定標，而腎組織中乳酸峰相對穩定，故用乳酸(δ 1.336)為標準對譜圖進行化學位移校正，將光譜分割為4500段，范圍從δ 0.50～9.50，每個區域寬度相等( δ 0.002) ，水峰δ 4.70～5.02區域切除。在樣品識別分析之前對集成數據進行歸一化，以消除由組織重量不同而導致的樣品之間的稀釋差異或體積質量差異。

將歸一化后生成的數據導入SIMCA-P 13.0(Umetrics，Ume，Sweden)中進行多元統計分析，首先采用PCA的無監督成分分析方法分析核磁共振光譜數據，以分離樣本，隨后采用PLS-DA和OPLS-DA的監督成分分析方法更好地進行樣本的分離。為了防止過度擬合，通過置換分析(200次) 和交叉驗證法，對OPLS-DA模型進行驗證。同時進行模式質量評價，用R2X、R2Y、Q2等指標進行質量評價，其中R2X表示X的變異百分比，R2Y表示Y的變異百分比，Q2表示累計預測結果的真實性。將OPLS-DA模型中所有峰值的變量和變量重要性投影(variable importance in the projection，VIP)的值作為峰值選擇的系數，并認為具有VIP>1的變量與群體分化有關[9]。此外，采用Tukey’s test (P<0.05) 進行分析，僅對具有統計學意義P<0.05的變量的數據進行鑒別，并根據P<0.05和VIP>1篩選出差異代謝物。

1.4.5差異代謝物識別 采用雙參數法歸屬差異代謝物，參照前期相關的文獻和代謝組學的數據庫網站( http：//www.hmdb.ca/)，只有同時滿足相應的化學位移和峰多態性的化合物，才被認為是真實發生變化的代謝物。再結合多變量數據和統計學分析結果，以VIP>1和P<0.05為篩選條件，最終確定尿液和腎臟中的差異代謝物。

2 結果

2.1 慢性高尿酸血癥腎病模型大鼠腎臟組織病理學及血清生化水平檢測腎臟組織病理學檢測顯示，慢性高尿酸血癥大鼠的腎臟已產生病理性萎縮，腎臟表面呈現不規則凹陷，髓質出現淡黃色斑點和放射狀紋路，而皮質邊緣變模糊(Fig 1A-D) ，并觀察到腎髓質、乳頭和錐體中的尿酸晶體沉積以及腎間質的炎癥，且有腎小球硬化、間質纖維化、腎小動脈硬化(Fig 2A-D)。以上結果表明，高尿酸血癥可誘發大鼠慢性腎病。

Fig 1 Kidney typical photos of control and hyperuricaemia ratsA：Typical kidney photo of control rats; B： Kidney longitudinal section photo of control rats; C：Typical kidney photo of hyperuricaemia rats; D： Kidney longitudinal section photo of hyperuricaemia rats.

采用血生化方法測定慢性高尿酸血癥模型大鼠相關指標水平。正常大鼠SUA為75.8 μmol·L-1，而模型大鼠為258.3 μmol·L-1，相比增加3倍，表明高尿酸血癥大鼠模型構建成功(Fig 2E)。對照組大鼠BUN和CREA水平分別為7.2 mmol·L-1和29.2 μmol·L-1，而模型大鼠分別為9.0 mmol·L-1和42.3 μmol·L-1，表明高尿酸血癥大鼠出現腎功能損傷(Fig 2G, 2H)。高尿酸血癥大鼠血清GLU也增加20%(Fig 2F)。

2.2 尿液和腎組織代謝輪廓分析慢性高尿酸血癥腎病大鼠尿液和腎組織的核磁圖譜見Fig 3。根據化學位移、峰形、偶合常數，并結合Metabolome數據庫對圖譜進行確認，在大鼠尿液中發現51個差異代謝物，腎組織中發現48個差異代謝物，包含大量參與多種生化過程的代謝物，如葡萄糖、氨基酸、NAD+和腺嘌呤等。

2.3 多元統計分析采用PCA散點圖對所有樣本進行分析，以顯示數據的原始分類狀態，可以在尿液(R2=0.872, Q2=0.702)和腎臟(R2=0.804,Q2=0.686)的PCA散點圖中均觀察到明顯的分離( Fig 4A, 4D) ，表明模型組大鼠尿液和腎臟中發生明顯的代謝紊亂。為優化兩組分離，本研究采用7倍交叉驗證法對OPLS-DA模型的可靠性進行驗證，圖4B ( R2X=0.758, R2Y=0.991, Q2=0.917) 和圖4E (R2X=0.776, R2Y=0.923, Q2=0.765) 分別為尿液和腎臟的OPLS-DA散點圖，同樣觀察到明顯的分離，表明慢性高尿酸血癥腎病大鼠機體生理及物質代謝發生明顯改變。

為進一步確定正常組和模型組的主要差異代謝物，從OPLS-DA分析中得到評分和相關系數載荷圖，根據UV模型的可變權重對載荷進行著色，如圖( Fig 4C, 4F) 顯示出兩組差異代謝物，根據兩組之間的化學位移( VIP>1和P<0.05) ，鑒定出多種差異代謝物( Tab 1,2) 。這些代謝產物均參與糖酵解、三羧酸循環 ( tricarboxylic acid cycle，TCA) 、尿素循環、氨基酸和蛋白質代謝、能量代謝以及抗氧化活性等關鍵代謝途徑。

Fig 2 Renal histopathology and serum biochemical results of hyperuricaemia and control A： Kidney microscopic image of control rats (×200); B： Kidney microscopic image of hyperuricaemia rats (×200); C： Kidney microscopic image of control rats (×400); D： Kidney microscopic image of hyperuricaemia rats (×400); E： SUA; F： GLU; G： BUN; H： CREA. *P<0.05, **P<0.01 vs control.

Fig 3 600 MHz representative 1H-NMR spectra of urine and renal tissue samples from hyperuricaemia and control ratsA： Urine samples of control rats; B： Urine samples of hyperuricaemia rats; C： Renal tissue samples of control rats; D： Renal tissue samples of hyperuricaemia rats.

Fig 4 Metabolite profiles of urine and renal tissue samples between hyperuricaemia and control ratsA： PCA scores plot, B： OPLS-DA scores plots, C： Color map of the urine samples between hyperuricaemia and control rats; D： PCA scores plot, E： OPLS-DA scores plots, F： Color map of the renal tissue samples between hyperuricaemia and control rats.

Tab 1 Summary of different metabolites between control and hyperuricaemia rats(urine)

Tab 2 Summary of different metabolites between control and hyperuricaemia(renal tissues)

2.4 潛在生物標志物的鑒定綜合分析以上結果顯示，在慢性高尿酸血癥大鼠尿液和腎臟中分別發現51和48個潛在差異代謝物，在尿液中，馬尿酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺以及甲基腺嘌呤等代謝物明顯增加；而葡萄糖、γ-氨基丁酸( GABA) 、牛磺酸、精氨酸、蘋果酸、富馬酸、煙酸鹽、甘露醇和肌醇則明顯減少。在腎臟中，而尿素、天冬氨酸和酪氨酸明顯增加；而葡萄糖、GABA、牛磺酸、精氨酸、甘露醇、NAD+、煙酸、蘋果酸以及α-酮戊二酸等代謝物則明顯減少。綜合兩組數據發現，葡萄糖、牛磺酸、精氨酸、甲基腺嘌呤和煙酸在尿液和腎臟中都發生明顯變化，且主要涉及糖酵解、TCA循環和氨基酸代謝途徑。這些代謝物可能是慢性高尿酸血癥腎病大鼠的潛在生物標志物( Fig 5) 。

3 討論

基于1H-NMR的代謝組學技術對慢性高尿酸血癥大鼠的尿液和腎臟進行檢測，分析其代謝物和代謝通路動態變化情況。造模結束后，模型組和對照組的代謝物得到良好分離。可見，代謝組學研究可以從慢性高尿酸血癥腎病復雜的內源性代謝物中發現其變化規律，也能夠促進此方法的臨床應用( Fig 6) 。

Fig 5 Fold change of metabolites of urine and renal tissue samples from hyperuricaemia and control rats

3.1 氧化應激牛磺酸是一種游離氨基酸，能抵消組織中的氧化活性。據報道，為減輕腎損傷患者的氧化活性，會用升高患者體內牛磺酸的方法進行治療[10]。在慢性高尿酸血癥大鼠的尿液和腎臟中都檢測出牛磺酸明顯降低，表明牛磺酸減輕氧化活性作用的潛在機制。因此，牛磺酸可作為高尿酸血癥大鼠氧化活性的生物標志物，通過氧化應激過程，導致腎功能受損。

3.2 能量代謝TCA循環是機體ATP產生的主要來源。慢性高尿酸血癥腎病大鼠的尿液和腎臟中TCA循環的多個中間代謝物，包括蘋果酸、富馬酸、α-酮戊二酸和枸櫞酸等明顯降低。此外，通過糖酵解降低葡萄糖的利用率可能會降低丙酮酸轉化為乙酰輔酶A的可能性，可見大鼠的TCA循環總體上受到抑制。

在能量代謝中，谷氨酰胺可以轉化為谷氨酸，谷氨酸是主要的細胞能量底物，可進入TCA循環[11]。而在高尿酸血癥大鼠中，谷氨酰胺的轉化和谷氨酸進入TCA循環可能有助于維持TCA循環的穩態。此外，谷氨酰胺水解也有助于氧化磷酸化過程中ATP和NAD+的產生。而NAD+作為能量代謝的關鍵組成部分[12]，在高尿酸血癥大鼠腎臟中明顯降低，可能與腎臟ATP水平降低密切相關。NAD+是線粒體呼吸、氧化磷酸化、DNA修復和核信號傳遞等各項生理過程所需的重要底物。NAD+的減少與老年人和嚙齒類動物氧化損傷的增加以及沉默信息調節因子2相關酶1( silent information regulator 2 homolog1，SIRT1)的活性降低有關[13]。SIRT1是NAD+依賴的組蛋白去乙酰化酶，與代謝功能障礙和能量代謝有關。此外，SIRT1還參與腎損傷的調節，包括與衰老相關的腎損傷、腎組織缺氧、腎間質纖維化和腎小管細胞凋亡[14]。雖然機制尚不清楚，但研究表明，NAD+的降低及其相關的SIRT1功能障礙可能與慢性高尿酸血癥腎病的發病機制有關。因此，SIRT1的活化可能成為防治腎損傷發生和發展的潛在靶點。

3.3 氨基酸代謝精氨酸是一種半必需氨基酸，內源性精氨酸的合成集中在肝臟和腎皮質上，腎臟中產生的大多數精氨酸被釋放到血液中，并分布在全身各處。在腎損傷大鼠中，精氨酸進入內皮細胞的運輸受到抑制，而促進精氨酸攝取的是陽離子氨基酸轉運蛋白1(cationic amino acid transporter 1，CAT1)。CAT1可轉運多種陽離子氨基酸，這可能競爭性抑制精氨酸的攝取。Schwartz等[15]的研究表明，精氨酸在腎損傷大鼠的主動脈和腎小球中轉運降低，并伴隨著CAT1水平降低。雖然其潛在機制尚未確定，但實驗研究表明，精氨酸的降低可能與慢性高尿酸血癥腎病的發病機制相關。

此外，大鼠犬尿氨酸途徑中的代謝物有所升高，而此途徑是由吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)所介導，IDO水平的升高與腎損傷中炎癥和免疫調節能力不足有關。有研究表明，血清中高水平IDO與腎病嚴重程度和腎損傷有關[16]。因此，IDO可能是防治慢性高尿酸血癥腎病很有前途的靶點，而未來研究可集中在IDO的調控機制上。