免疫性肝損傷過程中CYP2C19體內外活力測定的方法學建立

李曉霞，劉鳳婷，王 濤，林 琴，薛永志

(包頭醫學院藥物代謝與肝臟分子藥理研究所，藥理學教研室，內蒙古 包頭 014060)

CYP2C19細胞色素P450同工酶屬于家族2，亞家族C，多肽19，主要在肝臟中表達，但在小腸中可發現較低水平的酶。占肝臟CYP總含量的6.8%，是主要的6種CYP之一[1]。CYP2C19參與質子泵抑制劑的代謝，因此可影響胃酸反流治療，潰瘍預防和幽門螺桿菌的根除治療[2-3]。CYP2C19酶在氯吡格雷的兩個生物激活步驟中也起著至關重要的作用，從而導致重大心血管不良事件的風險降低或更高[1]；它影響抗抑郁藥治療和美沙酮替代療法以及伏立康唑的抗真菌作用[1,4-5]；CYP2C19代謝他莫昔芬影響乳腺癌患者的預后[1,6-7]。因此，CYP2C19對治療結果影響最大的5個醫學領域是腸胃病學、心臟病學、精神病學、真菌學和腫瘤學[1-7]。以往對CYP2C19的研究多基于其基因多態性，而在炎癥及免疫應激方面對代謝活力影響的研究甚少。我們在此基礎上，主要研究在免疫性肝損傷過程中[8-10]，CYP2C19的活力變化及代謝情況。因此，急需要建立體內和體外CYP2C19活力的檢測方法，來評估伴有炎癥和免疫刺激等情況下，代謝酶活性變化對上述5個醫學領域治療方案的影響，調整劑量和藥療方案，減少藥物不良反應和不必要的藥物相互作用，提高治療效果，做到個體化精準治療。

1 材料

1.1 主要實驗儀器Waters高效液相系統(1525泵， 2996-二極管陣列紫外可見檢測器，美國)、TGL-16C型離心機和TGL-20bR低溫高速離心機由上海安亭科學儀器廠提供、日本島津AUW120D型分析天平、上海本昂科學儀器有限公司NBI-24W型氮氣吹干儀、姜堰市新康醫療有限公司XK96-A型快速混勻器、上海賽默飛世爾儀器有限公司MuLtiskan FC型酶標儀，OptimaL-80XPULtracentrifuge低溫超高速離心機和3111型CO2培養箱、北京欣凱隆生物科技有限公司XHF-D型內切式勻漿機。

1.2 主要實驗試劑奧美拉唑鈉標準物質(含量：95.2%，批號：100760-201504)、BCG凍干粉(60 mg/支，批號：2016-01)，由中國食品藥品檢定研究院提供；奧美拉唑鈉注射液(批號：20180727G2)，從常州四藥制藥有限公司購買；奧美拉唑鎂腸溶片(批號：1912015)，購自阿斯利康制藥有限公司；武漢博士德生物工程有限公司提供BCA蛋白定量試劑盒(批號：12C17B46)；NADPH再生系統(批號：20180906)，從北京匯智泰康醫藥技術有限公司購買。無水甲醇(色譜純，批號：20191023)，天津市大茂化學試劑廠提供；其它實驗試劑為國產分析純。

1.3 動物♂SD清潔級大鼠，(180～220) g，購自內蒙古大學動物實驗中心，動物許可證號SCXK(蒙)2005-0001；♂昆明種清潔級小鼠，(18～22) g，從斯貝福北京生物技術有限公司引進,動物許可證號SCXK(京)2019-0010。

2 方法

2.1 HPLC方法學建立

2.1.1色譜條件 C18高效液相色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇 ∶水=50 ∶50(體內實驗)或甲醇 ∶0.01 mol·L-1K2HPO4= 60 ∶40(體外肝微粒體實驗)；流速設置為1 mL ·min-1；進樣量25 μL。OME對照品及代謝物5'-OHOME紫外檢測波長分別為304 nm和262 nm，柱溫30 ℃。

2.1.2標準曲線、線性范圍和檢出限 用天平稱取OME對照品5 mg加甲醇溶解配成500 mg·L-1的貯備液，置于4 ℃冰箱避光保存。吸取OME貯備液0.2 mL，并用甲醇稀釋為梯度濃度為0.25、0.5、1、2、5、10、20、30 mg·L-1的溶液，然后加入3 mL乙酸乙酯進行萃取，3 500 r·min-1離心10 min，分離上清置于玻璃試管中用氮氣吹干儀將其吹干，用300 μL流動相復溶，然后進行HPLC分析。用測得的樣品峰面積 (Y)對濃度(X)進行線性回歸，回歸方程為：Y=114 013X-239 51(R2=0.999 4，n=6)，在0.25～40 mg·L-1濃度范圍內線性關系良好，最低檢測限為0.05 mg·L-1，可用于后續實驗。

2.1.3日內/日間精密度(RSD)和回收率 利用10、20 mg·L-1高低2種濃度和各5個樣品測定的結果計算日內RSD；日間RSD也采用上述兩種濃度和樣品數在不同的5 d測定結果計算，詳見Tab 1。

Tab 1 OME intra-day differences，inter-day differences and recovery

2.2 實驗動物分組及免疫性肝損傷模型的制備♂ SD大鼠適應性飼養并正常自由進水進食。采用單次靜脈注射BCG (125 mg·kg-1)復制免疫性肝損傷模型，Control組靜脈注射等體積的生理鹽水。實驗d 14，將上述大鼠各分為兩組，一組尾靜脈注射奧美拉唑鈉(5 mg·kg-1)，另外一組灌胃奧美拉唑鎂腸溶片(50 mg·kg-1)。在給藥后分別按照不同時間點(靜脈注射2、5、8、15、20、30和120 min；灌胃0.5、0.75、1、1.5、2、3和4 h)進行眼內眥靜脈叢取血，之后采用HPLC法測定CYP2C19在體內的代謝活性。

♂昆明種小鼠稱體質量、標號，按隨機數列表分為Control、BCG組。采用單次靜脈注射BCG (125 mg·kg-1)復制免疫性肝損傷模型，Control組靜脈注射相同體積的生理鹽水。實驗d 14頸椎脫臼法處死小鼠，門靜脈灌流法沖洗肝臟，迅速取出小鼠肝臟，提取肝微粒體，HPLC法測定CYP2C19體外代謝活性。

3 結果

3.1 免疫性肝損傷對大鼠奧美拉唑在體內代謝活性的影響

3.1.1體內代謝的藥時曲線考察 大鼠尾靜脈注射奧美拉唑鈉5 mg·kg-1或灌胃奧美拉唑鎂腸溶片50 mg·kg-1后，用內徑1 mm的細玻璃管于給藥后從大鼠眼內眥靜脈叢取血0.2 mL于肝素化試管中，取血點分別是2、5、8、15、20、30、120 min(注射)或30、45、60、90、120、180、240 min(灌胃)。血樣經3 500 r·min-1離心10 min，分離血漿。精確吸取血漿200 μL于離心管中，加入乙酸乙酯3 mL渦旋震蕩5 min，3 500 r·min-1離心10 min進行萃取。分離上清置于玻璃試管中，40 ℃氮氣吹干，300 μL流動相復溶，渦旋混勻過濾后進樣，供HPLC分析檢測。BCG免疫性肝損傷導致探針藥物OME在灌胃給藥后5、8、15、20、30 min血藥濃度明顯高于Control(P<0.05)，表明CYP2C19代謝活力降低，見Fig 1。與上述結果相似，BCG免疫性肝損傷導致探針藥物OME在注射給藥后60、90、120、180 min血藥濃度明顯高于Control(P<0.05)，表明CYP2C19代謝活力降低，見Fig 2。

Fig 1 Effect of immune liver injury on blood concentration of OME in *P<0.05，**P<0.01 vs control

Fig 2 Effect of immune liver injury on blood concentration of OME in *P<0.05，**P<0.01 vs control

3.1.2體內代謝的藥物代謝動力學參數考察 將大鼠體內血藥濃度的經時變化代入DAS 3.0藥代動力學分析軟件進行分析，經計算機擬合，大鼠體內奧美拉唑代謝符合二房室模型。藥代動力學參數見Tab 2和Tab 3，兩種給藥途徑的藥代動力學參數出現相似的結果。BCG免疫性肝損傷組大鼠血漿消除半衰期(T1/2)延長，清除率(CL)減慢，曲線下面積(AUC(0-t))明顯增大，與Control比較差異具有顯著性(P<0.05)，而消除速率常數(Ke)和表觀分布容積(V)則無顯著變化。表明BCG組大鼠CYP2C19代謝活力降低。

Tab 2 Pharmacokinetic parameters of intravenous injection of OME in rats

Tab 3 Pharmacokinetic parameters of oral OME in rats

3.2 HPLC法測定CYP2C19在體外的代謝活性

3.2.1小鼠肝微粒體的制備方法及其體外方法學建立 實驗小鼠禁食12 h，自由飲水，實驗當日將其麻醉后，采用冰冷生理鹽水門靜脈灌流，沖洗肝臟，使其呈土黃色。取適量肝組織于玻璃試管中，加入25%磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，內切式勻漿機3 500 r·min-1，0.2 min制備肝組織勻漿液。

3.2.1.1 差速離心法分離小鼠肝微粒體 4 ℃，10 000 r·min-1離心20 min肝勻漿液，分離并保留上清。上清再置于超高速離心機4 ℃，100 000 r·min-1離心1 h。用25%磷酸鹽緩沖液中重懸離心后的粉紅色微粒體沉淀物，貯存于-80 ℃冰箱備用。

3.2.1.2 鈣沉淀法分離小鼠肝微粒體 將肝臟勻漿液在低溫高速離心機4 ℃，12 000 r·min-1離心20 min，保留上清。按照10 ∶1的比例于上清中加入CaCl2溶液(88 mmol·L-1)，充分混勻后，15 000 r·min-1離心30 min，棄上清，沉淀物中再適量加入25%磷酸鹽緩沖液，15 000 r·min-1再次離心30 min。丟棄上清后所得。加入25%磷酸鹽緩沖液適量，重懸上述粉紅色肝微粒體沉淀物，置于-80 ℃冰箱儲存備用。

3.2.1.3 BCA法測定小鼠肝微粒體的蛋白質濃度 按照蛋白樣本 ∶生理鹽水=1 ∶30的配比將其稀釋到適宜濃度，進行標準品溶液的配制。把標準品溶液以及稀釋好的蛋白樣本適量逐個加入96孔板中，再加入200 μL BCA工作液，充分混勻后，把96孔板放在CO2培養箱中37 ℃孵育30 min。把冷卻到室溫后的酶標板置于酶標儀內測定其在562 nm處的吸光度。把測得標準品溶液(Y)濃度對吸光度值(X)做線性回歸方程，得標準品溶液的標準曲線回歸方程：Y=0.000 2X+0.199 6，R2=0.997 3。

3.2.1.4 構建小鼠肝微粒體孵育體系 孵育體系總體積為200 L，由肝微粒體、Tris-鹽酸緩沖液，NADPH 1 mmol·L-1、探針藥物OME組成。適量濃度體積的肝微粒體中分別加入不同質量濃度的OME和Tris-鹽酸緩沖液，先在37 ℃的CO2培養箱中預孵育5 min，然后加入NADPH(A液 ∶B液=5 ∶1)啟動催化反應，30 min后加入3倍體積的乙酸乙酯終止反應。旋渦5 min， 8 000 r·min-1離心10 min，把置于玻璃試管中的上清液40 ℃氮氣吹干，用300 L流動相復溶，HPLC進樣對CYP2C19體外代謝活性進行測定。OME的終質量濃度分別為400、500 mg·L-1。

3.2.1.5 不同微粒體濃度對OME代謝影響 以15 mg·L-1的OME加入孵育系統，觀察不同微粒體濃度對代謝率的影響，結果見Fig 3。根據數據，認為15 mg·L-1的底物濃度，0.7 g·L-1的微粒體濃度的孵育體系最為合適。

Fig 3 Effects of different microsome concentrations on OME metabolism

3.2.1.6 不同底物濃度對OME代謝影響 見Fig 4。根據上圖數據，選擇孵育體系中加入0.7 g·L-1的微粒體，進行不同底物濃度對代謝影響的實驗，結果顯示，10～20 mg·L-1的底物濃度處于曲線的中間部分，適合做后續實驗。

3.2.1.7 不同孵育時間對OME代謝的影響 按著上述實驗結果，選擇0.7 g·L-1的微粒體15 mg·L-1的底物濃度加入孵育體系，觀察不同的孵育時間對代謝率的影響。結果顯示，孵育20 min最合適。見Fig 5。

3.2.1.8 差速離心法和鈣沉淀法制備微粒體代謝率的比較 見Fig 3，經統計學檢驗，各個微粒體濃度下，兩種方法的代謝率相似，沒有顯著性差異。相對于差速離心法，鈣沉淀法更加便捷，不需要超高速低溫離心機，可做大樣本的實驗。見Fig 6。

Fig 4 Effect of different substrate concentrations on OME metabolism

Fig 5 Effect of different incubation time on OME metabolism

Fig 6 Comparison of metabolic rate between two microsome preparation methods

3.2.2BCG誘導免疫性肝損傷對CYP2C19體外代謝活力的影響 結果如Fig 7，以5-OHOME生成率描述代謝率，反映CYP2C19體外代謝活力。與對照組比較，BCG組OME代謝活力明顯降低，差異具有顯著性(P<0.05)。表明CYP2C19代謝活力下降。在400、500 mg·L-1兩個濃度都得到了相同的結論。應用Michaelis-Menten方程和Eadie-Hofstee制圖法，計算米氏常數Km和最大反應速度Vmax。Control組Vm值為82.9 nmol·min-1·mg protein，Km值為50.1 μmol·L-1；BCG組Vm值為38.6 nmol·min-1·mg protein，Km值為18.2 μmol·L-1)，表明BCG組大鼠底物親和力降低(Km)，酶促反應速度減慢(Km)。

Fig 7 Effect of BCG immune liver injury on metabolic rate of *P<0.05，**P<0.01 vs control

4 討論

本研究建立了以OME為探針藥物，從而考察CYP2C19在體內、體外代謝活性的研究方法。通過尾靜脈及灌胃給藥后，檢測血漿中OME及其代謝物5'-OHOME的血漿藥物濃度經時變化曲線。另外將OME經肝微粒體孵育體系后，檢測其與5-OHOME的生成、代謝速率，以此來反映CYP2C19在體外的活性變化。經過本實驗系統地研究，體內CYP2C19代謝采用靜脈注射大鼠模型，相對于口服給藥，數據相對準確，影響因素小。而口服給藥可能受到過多的吸收效率的個體差異的影響，數據變動范圍較大。體外肝微粒體孵育系統實驗可以更好地判斷肝臟藥物代謝酶的代謝活力，而體內實驗是肝臟和其它還有CYP2C19代謝酶亞型的器官代謝活力的總和。體外實驗還證實，鈣沉淀法較沿用了多年的差速離心法更加方便，數據也較穩定，適合檢測肝臟微粒體代謝活力。分析其原因可能是CYP2C19位于線粒體和內質網的內膜上，細胞破碎的程度決定酶提取的多少，內切式勻漿機定轉速和時間可實現每個樣本均一的破碎程度，微粒體蛋白定量的準確性進一步保證了數據的準確性，鈣沉淀法完全可以高效、簡便和大樣本的進行肝臟微粒體實驗，避免了超高速冷凍離心機的限制。孵育體系條件的精準性也是實驗成功的決定因素。孵育時間、底物濃度和微粒體的濃度都進行了系統地實驗，摸索出了合適的條件。

作為6種主要的CYP450家族中重要的一個亞族，CYP2C19活性除了受基因多態性影響，細菌、病毒等感染造成的免疫性肝損傷亦明顯影響其活性，進而可影響機體對藥物的暴露程度，產生藥物不良反應或藥物相互作用，影響個體化用藥藥療方案的制定[1]。CYP2C19參與的藥物代謝有[1-7]：質子泵抑制劑埃索美拉唑、蘭索拉唑、奧美拉唑、托拉唑、雷貝拉唑；抗抑郁藥阿米替林；抗血小板藥氯吡格雷；5-羥色胺再攝取抑制劑類抗焦慮藥西酞普蘭、依他普侖；三環抗抑郁藥氯米帕明和丙咪嗪；抗焦慮藥氧異安定、地西泮；止痛藥美沙酮；抗真菌藥伏立康唑；抗雌激素他莫昔芬；抗病毒奈非那韋。BCG誘導的免疫性肝損傷過程中[8-10]，CYP2C19代謝活力下調，可影響上述多種藥物的代謝，從而影響腸胃病學、心臟病學、精神病學、真菌學和腫瘤學5大醫療領域的藥物治療。根據本研究，在免疫性肝損傷過程中，可合理調整上述5大領域的藥療方案，做到精準治療，個體化治療。