大黃素甲醚對酒精性肝損傷中SIRT1-AMPK通路的影響

王瑞婕，楊 勇，白 婷

(大連大學醫學院，遼寧 大連 116622)

在我國，酒文化源遠流長，隨著我國飲食結構和生活方式的改變，酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)的發病率迅速增加，其引起的健康問題嚴重威脅我國人民的身體健康和社會發展[1]。ALD是指長時間乙醇作用導致肝細胞壞死和永久性結構破壞的肝病嚴重形式，包括輕癥酒精性肝病(mild alcoholic injury)、酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver)、酒精性肝炎(alcohol hepatitis)、酒精性肝纖維化(alcoholic hepatic fibrosis)和酒精性肝硬化(alcoholic cirrhosis)等5種類型[2]。酒精性脂肪肝是指由于長期大量的酒精攝入導致的肝臟脂肪代謝異常的疾病。酒精進入機體，大部分會在肝臟被代謝，由于人體代謝能力有限，最終會引起肝內的脂肪堆積，脂肪變性、壞死，從而導致脂肪肝。

沉默信息調節因子蛋白1(silent information regulator factor 2 related enzyme 1，SIRT1)，是NAD+依賴的Ⅲ型組蛋白脫乙酰酶，主要通過對組蛋白、轉錄因子及其它蛋白修飾的賴氨酸殘基進行去乙酰化，調節基因、蛋白的表達[3]。酒精的攝入可通過脂聯素、乙醛、乙酸脂多糖、氧化應激等多種方式抑制SIRT1的活性及表達，進而多種轉錄因子的活性被抑制或被激活，誘發一系列級聯反應，從而調節脂肪合成以及脂肪酸氧化過程，因此形成酒精性脂肪肝[4]。伴隨酒精攝入量的不斷增加，呈現漸進性發展趨勢，可發展至酒精性肝炎、酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化甚至肝癌[5]。Yang等[6]發現，在C57BL/J小鼠肝臟和HepG2細胞中，α-硫辛酸可以增強SIRT1去乙酰化酶的活性，通過去乙酰化肝臟激酶1(LKB1)，激活SIRT1/LKB1/腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)信號通路，發揮調節代謝的作用。LKB1通過磷酸化AMPKα亞基(Thr172)并抑制磷酸化酶對AMPK的去磷酸化作用從而使其激活[7]。AMPK是能量代謝的關鍵調節因子，因其活性受AMP/ATP比值調控，被稱作細胞的“能量監測器”，在維持機體能量代謝平衡、葡萄糖及脂肪酸代謝、細胞代謝等過程中發揮重要的調節作用[8]。當胞內AMP與ATP的比值增加時，AMPK的磷酸化使下游靶分子激活，一方面糖原、脂肪和膽固醇的合成被抑制，即減少了ATP的利用，另一方面細胞的分解代謝增加，促進脂肪酸氧化、糖酵解，即增加了ATP的產生；當AMP與ATP的比值減少時，細胞的合成代謝增加，則AMPK的活性受到抑制[9]。固醇調節元件結合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)是調節脂肪合成的關鍵核轉錄因子，屬于固醇調節元件結合蛋白家族成員中的一員。在研究酒精性脂肪肝時發現，SREBP-1c是AMPK的一個直接靶蛋白，AMPK抑制SREBP-1c活性是通過磷酸化SREBP-1c的372絲氨酸位點，調節蛋白裂解成熟和核內轉位過程，進而抑制固醇調節元件依賴的促脂靶蛋白脂肪酸合成酶的表達[10]。在酒精性肝炎的研究中，基于肝臟巨噬細胞和肝細胞的交叉對話，調控SIRT1-LKB1-AMPK-SREBP1c通路可抑制脂肪生成和肝臟脂質沉積，從而緩解酒精性肝病的進程[11]。

大黃素甲醚(physcion，PHY)屬蒽醌類化合物，又名朱砂蓮乙素、非斯酮，是分布最廣泛的一種蒽醌類物質，主要從中草藥蓼科植物大黃中提取得到。研究發現，大黃素甲醚具有抗炎性因子、抗氧化、抗癌、抗菌以及抗白血病等多種藥理活性[12]。此外，大黃素甲醚對膽汁淤積肝損傷有一定的保護作用[13]。因此，本研究擬針對大黃素甲醚，探討其對酒精性肝損傷中SIRT1-AMPK通路的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物8～10周齡C57BL/6小鼠，健康♂，體質量約(20±2)g，由大連醫科大學動物中心提供，許可證號為SCXK(遼)2004-0017。

1.2 藥物與試劑大黃素甲醚(純度>99%，北京索萊寶科技有限公司)；SRT1720(SIRT1激動劑)、AICAR(AMPK激動劑)(純度>99%，MCE公司)；Lieber-DeCarli酒精液體飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司)；谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)試劑盒、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)試劑盒、甘油三酯(triglyceride，TG)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；SIRT1抗體、AMPKα抗體、p-AMPKα抗體、GAPDH抗體(Cell Signaling Technology公司)；SREBP-1c抗體(Abcam公司)；IL-1β ELISA試劑盒(美國PeproTech公司)。

1.3 儀器高速冷凍離心機、Multiskan FC酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；蛋白電泳轉膜系統(美國Bio Rad公司)。

2 方法

2.1 動物分組將36只C57BL/6小鼠，隨機分為6組，即正常對照組(Control)、酒精飼料組(EtOH)、酒精飼料+SRT1720組、酒精飼料+AICAR組、酒精飼料+大黃素甲醚組(PHY 20、40 mg·kg-1)，每組6只。

2.2 模型構建采用美國國立衛生院酒精濫用與酒精中毒研究所(National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism，NIAAA)肝病研究室建立ALD模型的方法建立小鼠酒精性肝損傷模型[12]。首先給予6組小鼠5 d對照飲食，作為液體飲食的適應期，隨后正式開始實驗：正常對照組繼續給予對照液體飲食；其余5組改為含5%酒精的Lieber-DeCarli液體飼料喂養，共喂養10 d，每天上午7～9點之間更換飲食。正常對照組根據小鼠體質量灌胃給予生理鹽水。酒精飼料+SRT1720組灌胃給予50 mg·kg-1SRT1720，酒精飼料+AICAR組灌胃給予500 mg·kg-1AICAR，酒精飼料+大黃素甲醚組分別灌胃給予20、40 mg·kg-1大黃素甲醚，連續10 d。d 11除對照組外，其余5組各酒精灌胃(5 g·kg-1體質量)1次，對照組給予等熱量麥芽糖糊精灌胃1次。9 h后處死小鼠，收集血清，分離肝臟，肝臟左葉用10%中性福爾馬林浸泡用于病理檢測，其余部分放于-80 ℃冰箱內保存，用于后期Western blot蛋白印跡實驗。

2.3 肝臟外觀形態觀察及肝指數測定小鼠稱體質量后眼球取血，頸椎脫臼處死，剖取肝臟，將肝組織置于6 cm培養皿中，用高倍相機在同視野下拍照觀察外觀形態。生理鹽水洗血，濾紙吸干后稱肝質量。肝指數/%=肝臟質量(g)/體質量(g)×100%。

2.4 血清生化指標檢測使用ALT、AST、TG檢測試劑盒測定血清中三者含量。

2.5 肝組織病理觀察取出在10%中性福爾馬林緩沖液中固定的肝組織，包埋在石蠟中。用旋轉切片機將肝臟包埋塊切成5 μm厚度，常規HE染色。200倍光學顯微鏡下觀察分析肝組織病理學改變。

2.6 免疫組織化學實驗采用常規免疫組化染色，用石蠟包埋肝組織，切片脫蠟至水，抗原修復，內源性過氧化物酶封閉后一抗4 ℃孵育過夜，增強劑孵育后二抗室溫孵育20 min，DAB顯色后蘇木精復染，脫水、透明、封片，200倍光學顯微鏡下觀察SIRT1、p-AMPKα表達情況。

2.7 ELISA檢測細胞因子IL-1β含量取肝臟標本，按照ELISA試劑盒的說明書進行操作，測定肝臟中IL-1β的含量。

2.8 Western blot檢測蛋白表達水平從-80 ℃冰箱中取出肝臟組織稱質量后，利用液氮和研缽將其粉碎成細粉。加入組織裂解液進一步勻漿研磨，冰上放置充分裂解，30 min后，4 ℃，1 000 r·min-1離心15 min，上清即為肝臟總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，95 ℃熱浴5 min使蛋白變性。采用10% SDS-PAGE膠進行電泳，濕法轉膜；5%脫脂奶室溫封閉1 h后，加入封閉液稀釋的AMPKα(兔抗，1 ∶1 000)、p-AMPKα(兔抗，1 ∶500)、SIRT1(鼠抗，1 ∶1 000)、SREBP1c(兔抗，1 ∶5 000)抗體和內參GAPDH(兔抗，1 ∶1 000)抗體，4 ℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗膜，加入相應二抗室溫孵育1 h后，ECL顯色，暗室中用X膠片感光、顯影、定影、掃描圖片。

3 結果

3.1 大黃素甲醚對酒精誘導小鼠狀態與肝指數的影響Lieber-DeCarli液體酒精飼料慢性喂養10 d，酒精模型組小鼠出現活動量減少，小鼠體質量減輕，正常對照組小鼠毛色光滑，活動積極。PHY、SRT1720、AICAR各組小鼠毛色略有改善，活動量與精神狀態也略有改善。肝指數在一定程度上反映肝臟腫脹情況，大黃素甲醚各組肝指數雖有所降低，但無統計學意義，見Fig 1。

Fig 1 Ratios of liver to body

3.2 大黃素甲醚對血清中ALT、AST、TG含量的影響與正常對照組相比，酒精模型組小鼠血清中ALT、AST、TG含量明顯高于正常組(P<0.01)，與酒精模型組相比，大黃素甲醚PHY以及SRT1720、AICAR激動劑組小鼠血清ALT、AST、TG明顯降低(P<0.01)，且大黃素甲醚高劑量組要低于各激動劑組，見Tab 1。

Tab 1 Comparison of serum ALT，AST，TG content

3.3 大黃素甲醚對小鼠肝組織病理變化的影響如Fig 2所示，大體觀察肝臟表面顏色和光滑度，正常組小鼠肝臟表面光滑，顏色呈紅褐色，酒精模型組小鼠肝臟表面粗糙，色澤較正常組小鼠暗淡。HE染色觀察肝內結構，炎癥水腫等病理損傷，正常組小鼠肝臟未見明顯病變，肝細胞結構正常，內無脂滴形成，肝細胞無脂肪變性。酒精模型組小鼠肝臟不同程度的水腫，脂質內分布有許多脂肪空泡，有點狀、片狀壞死及炎性細胞浸潤。大黃素甲醚組以及SRT1720、AICAR激動劑組小鼠肝臟腫脹程度明顯減輕，肝組織變性程度也明顯減輕，說明大黃素甲醚在一定程度上減輕肝細胞的脂肪變性與炎性細胞浸潤。

3.4 大黃素甲醚對肝臟組織中IL-1β的影響為了觀察大黃素甲醚對酒精性肝損傷小鼠肝臟炎癥的影響，采用ELISA測定肝臟IL-1β水平。與正常對照組相比，酒精模型組小鼠肝臟中IL-1β水平明顯升高(P<0.01)，與模型組相比，SRT1720及AICAR組IL-1β表達明顯降低，大黃素甲醚高低劑量給藥組明顯降低IL-1β水平(P<0.01)，且存在劑量依賴性，見Fig 3。

Fig 2 Pictures and pathological changes of mouse liver(HE×200)A: Control; B: EtOH; C: SRT1720; D: AICAR; E: PHY (20 mg·kg-1); F: PHY (40 mg·kg-1)

Fig 3 Effect of PHY on IL-1β in mice with##P<0.01 vs control; **P<0.01 vs EtOH.

3.5 大黃素甲醚對小鼠肝臟中SIRT1、p-AMPKα表達的影響免疫組化染色測定PHY及各激動劑對小鼠肝臟中SIRT1、p-AMPKα表達的影響，采集高倍視野圖像，Fig 4結果顯示，SIRT1、p-AMPKα細胞染色呈黃色或棕黃色為陽性，與正常對照組相比，酒精模型組小鼠肝臟SIRT1、p-AMPKα蛋白表達明顯減少；與酒精模型組相比，SRT1720及AICAR組SIRT1、p-AMPKα表達明顯增強，大黃素甲醚組SIRT1、p-AMPKα表達呈劑量依賴性升高。

3.6 大黃素甲醚對肝臟組織中SIRT1、AMPKα、p-AMPKα、SREBP1c蛋白水平的影響從Fig 5結果可知，與正常對照組相比，酒精模型組SIRT1表達以及AMPKα的磷酸化水平受抑制。與酒精模型組相比，SRT1720及AICAR組SIRT1表達及AMPKα的磷酸化水平明顯升高，大黃素甲醚高低劑量給藥組SIRT1表達及AMPKα的磷酸化水平明顯增加，且存在劑量依賴性(P<0.01)。此外，與正常對照組相比，酒精模型組SREBP1c蛋白表達增加，與酒精模型組相比，PHY高低劑量給藥組以及SRT1720、AICAR組均明顯地降低了SREBP1c蛋白表達(P<0.01)。

Fig 5 Expression of SIRT1，AMPKα，p-AMPKα，SREBP1c in liver tissues of mice##P<0.01 vs control; *P<0.05，**P<0.01 vs EtOH.

Fig 4 Expression of SIRT1 and p-AMPKα in liver tissues of mice in each group(×200)A: Control; B: EtOH; C: SRT1720; D: AICAR; E: PHY (20 mg·kg-1); F: PHY (40 mg·kg-1)

4 討論

過度飲酒會導致脂肪肝的發生，它是ALD的最早期階段，20%～40%的重度飲酒者會發展為更嚴重的ALD，包括酒精性肝炎和肝硬化。許多酒精性肝炎患者都有長期慢性飲酒史，最近伴有酗酒、醉酒的病史[14]，同樣，實驗動物模型也發生上述變化。NIAAA模型(Gao-Binge模型)與人類的飲酒方式高度接近，可模擬人酒精性肝炎的發病過程，表現為肝臟有較嚴重的脂肪變性和炎癥，中性粒細胞浸潤明顯，血清中酒精濃度較高，ALT水平明顯升高[15]。因此，本研究采用含酒精的Lieber-DeCarli飲食喂養小鼠10 d，然后用單劑酒精灌胃1次建立酒精性肝損傷模型。本研究顯示，小鼠模型組的肝臟內脂滴沉積，炎性細胞浸潤，說明Lieber-DeCarli慢性喂養加急性酒精灌胃成功建立小鼠酒精性肝損傷，且PHY給藥組的小鼠肝臟內脂肪沉積隨濃度增加而有所改善。有研究表明大黃甲醚能夠抑制肝臟巨噬細胞促分裂原激活蛋白激酶和核轉錄因子κB激活，從而發揮抗炎的作用[16]。為了觀察PHY對肝細胞炎癥損傷的影響，采用ELISA測定IL-1β水平，實驗結果表明PHY能夠抑制酒精誘導的IL-1β水平，同時，SIRT1激動劑以及AMPK激動劑均能降低IL-1β水平，說明PHY能夠抑制酒精性肝損傷的炎癥反應。

肝臟是SIRT1主要表達的器官之一，SIRT1可調節基因表達、參與糖脂代謝、調節炎性反應等許多病理生理過程。為了進一步探討PHY緩解酒精性肝損傷的機制，我們研究了其對SIRT1-AMPK通路的作用。酒精性肝損傷可以降低SIRT1的表達，肝內過表達SIRT1可防止由ALD引起的肝臟脂質代謝損傷[17]。本研究結果顯示，在酒精性肝損傷小鼠中，肝臟SIRT1表達量下降，而給予PHY后，SIRT1表達量明顯升高，且給予SIRT1激動劑SRT1720組其表達量也明顯升高，顯示SIRT1在酒精性肝損傷中起調控作用。SIRT1下游分子AMPK是廣泛分布于生物體內的高度保守的蛋白激酶，具有抗氧化應激、抗炎和抗凋亡等多種生物學作用，可抑制脂肪酸與甘油三酯的合成，促進脂肪酸氧化分解，從而影響脂質代謝。在肝臟中，AMPK通過磷酸化作用調節脂質代謝，其下游蛋白激酶SREBP-1c是調控脂質合成與代謝的關鍵調控分子，在酒精性肝損傷的發生發展中起著重要作用。本研究結果中，酒精性肝損傷小鼠肝組織p-AMPKα蛋白水平降低，SREBP-1c表達量增加，經PHY干預后，AMPKα的磷酸化增加，SREBP-1c表達減少，且AMPK激動劑AICAR組SREBP-1c表達量也明顯降低。總之，我們的研究結果提示PHY可能通過激活SIRT1-AMPK通路，調節脂質合成與代謝的關鍵調控分子，抑制脂肪酸合成，從而在緩解酒精性肝損傷中發揮重要作用，但是更深入的機制需采用SIRT1基因敲除鼠及細胞的進一步研究來揭示。

綜上所述，PHY能夠改善慢性喂養液體酒精飼料加急性酒精灌胃所引起的脂肪變性損傷和炎癥水平，對肝臟具有一定的保護作用，其機制可能與SIRT1-AMPK信號通路的活化相關，確切機制有待深入探索。