銀杏酸對腫瘤的作用研究進(jìn)展

肖 玉，李 芬，陶澤璋

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，湖北 武漢 430060)

銀杏屬于銀杏植物科。銀杏樹被認(rèn)為是地球上最古老的生物之一，已經(jīng)在森林中繁衍了1.5億年，因此被稱為“活化石”[1]。它已被用作傳統(tǒng)藥物，其葉中含有各種糖苷和萜類化合物，它們可以發(fā)揮多種藥理活性，例如抗炎、光保護(hù)、保肝,以及在心血管疾病預(yù)防和治療中的強(qiáng)心作用等[2-4]。現(xiàn)已有成熟的銀杏葉提取物(ginkgo biloba P.E，GBE)制劑應(yīng)用于臨床，作為認(rèn)知功能下降和阿爾茲海默癥的治療用藥。大量藥理研究表明，GBE中萜烯三內(nèi)酯和類黃酮在認(rèn)知功能減退治療中發(fā)揮主要藥理作用[5]。銀杏酸(ginkgolic acid，GA)也存在于銀杏葉提取物制劑中，由于其潛在毒性，將含量控制在5×10-6以下也成為這種提取制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。此時銀杏酸的藥用價值還未得到發(fā)掘跟重視，是被當(dāng)成一種有害物質(zhì)來認(rèn)識的。自1997年發(fā)現(xiàn)銀杏酸以來，它的分離純化也一直在發(fā)展進(jìn)步。2001年，Teris等[6]利用雙柱高效液相色譜法從銀杏葉中分離出5種銀杏酸，分別為C13：0、C15：0、C15：1、C17：1、C17：2。這其中C15：1，C17：1以及C17：2含量相對較高。相對應(yīng)的，關(guān)于銀杏酸的大部分研究也是圍繞C15：1和C17：1這兩種來展開。

自銀杏酸被作為單獨(dú)化合物分離以來，關(guān)于其生物活性的研究報道不斷涌現(xiàn)。所覆蓋領(lǐng)域也相當(dāng)廣，早期主要包括抗菌活性、神經(jīng)保護(hù)作用、病毒的抑制活性、抗炎活性等等。近年來，銀杏酸的抗腫瘤作用被認(rèn)知并逐漸受到越來越多人的關(guān)注。到底這種存在于中國傳統(tǒng)草藥銀杏中的酚酸類化合物對腫瘤的抑制作用如何呢？本文將根據(jù)文獻(xiàn)研究，從銀杏酸對腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移的抑制作用入手，探討其發(fā)揮影響的深層機(jī)制，從而進(jìn)一步提高我們對銀杏酸的認(rèn)識。

1 銀杏酸的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性

銀杏酸是銀杏葉中結(jié)構(gòu)相關(guān)的正烷基酚酸化合物的混合物，是6-烷基或6-烯基水楊酸的衍生物。根據(jù)側(cè)鏈的不同可分為五種，結(jié)構(gòu)見Fig 1，其中C15:1含量較高，在其中具有代表性。

Fig 1 Molecular structures of ginkgolic acids

銀杏酸具有多種生物學(xué)特性。根據(jù)文獻(xiàn)，銀杏酸可直接結(jié)合E1連接酶，通過阻斷E1-SUMO中間體的形成來廣泛抑制蛋白質(zhì)SUMOylation(SUMO化)[7]，它的許多功能也與SUMO化密不可分。例如，銀杏酸作為SUMO化抑制劑，有助于抑制α-突觸核蛋白和tau蛋白的聚集，為帕金森病以及阿爾茲海默癥的治療提供新思路[8-9]。銀杏酸在部分腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮作用也與其SUMO化抑制劑的角色有關(guān)。銀杏酸具有破壞MDCK細(xì)胞中線粒體和溶酶體的潛在能力，可能有潛在腎毒性[10]。銀杏酸還具有肝毒性， Jiang等[11]的研究表明銀杏酸C15：1引起許多代謝紊亂，包括氧化應(yīng)激和嘌呤代謝，引起肝損傷。另外，藥物動力學(xué)分析表明，銀杏酸Ⅰ和Ⅱ相代謝在人和大鼠肝微粒體中具有相似的代謝特征。參與GA(17 ∶1)代謝的藥物代謝酶為人CYP1A2，CYP3A4，UGT1A6，UGT1A9和UGT2B15[12]。總的來說，銀杏酸能抑制SUMO化，還可抑制部分酶的活性，但有肝腎毒性。除此之外，銀杏酸具有較廣泛的生物活性，其中抗腫瘤特性是近年來研究的熱點(diǎn)及重點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)表明，其可在結(jié)腸癌、胃癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌以及乳腺癌的治療中發(fā)揮積極的作用，通過不同途徑抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

2 銀杏酸對腫瘤的抑制作用

腫瘤的生長增殖及侵襲轉(zhuǎn)移受眾多因素的調(diào)控。隨著腫瘤發(fā)病率的日益提高，尋找高效抗腫瘤藥物迫在眉睫。近年的研究發(fā)現(xiàn)，銀杏酸作為實(shí)驗(yàn)中的治療用藥在抑制腫瘤方面有重要的作用。

2.1 銀杏酸與細(xì)胞增殖腫瘤細(xì)胞的增殖能力關(guān)乎其生長速度，是評判其良惡程度的指標(biāo)之一。對細(xì)胞增殖的抑制作用也是篩選抗腫瘤藥物的一個重要方向。銀杏酸以濃度和時間依賴的方式抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480細(xì)胞的增殖，當(dāng)加入50 μmol·L-1銀杏酸時，細(xì)胞增殖幾乎被完全抑制[13]。它還顯著降低肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和HI299細(xì)胞的細(xì)胞增殖[14]。在與銀杏酸(10 μmol·L-1)共孵育24 h后，口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113和Cal-27的細(xì)胞活力分別降低了約41.79%和53.53%[15]。人胃癌細(xì)胞系，包括BGC-823、SGC-7901、MGC-803和AGS對銀杏酸治療敏感,其中BGC-823和SGC-7901比其他兩個更敏感[16]。在乳腺癌中，Licciardello等[17]發(fā)現(xiàn)對于NOTCH1激活的乳腺癌細(xì)胞系HCC-38， HCC-1187， HCC-2218和BT-20，銀杏酸可顯著抑制其增殖； Lorente等[18]通過Ki67的表達(dá)評估乳腺癌細(xì)胞的增殖時，證實(shí)暴露于銀杏酸(10 μmol·L-1)會導(dǎo)致增殖降低，并降低與乳腺癌細(xì)胞增殖有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子JUN的水平。這種現(xiàn)象不僅出現(xiàn)在體外作用中，實(shí)驗(yàn)表明銀杏酸同樣抑制乳腺癌異種移植物的生長，在體內(nèi)發(fā)揮作用[18]。這種抑制作用對于正常細(xì)胞與癌細(xì)胞來說具有差異性。Yao等[12]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了銀杏酸在原代大鼠肝細(xì)胞中的細(xì)胞毒性低于HepG2細(xì)胞。銀杏酸在培養(yǎng)4 d的原代大鼠肝細(xì)胞中無明顯細(xì)胞毒性，而濃度為60 μmol·L-1的銀杏酸降低了HepG2細(xì)胞90%的細(xì)胞活力。Ma等[19]發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度低于100 μmol·L-1時，銀杏酸可以抑制癌細(xì)胞的生長，而對正常細(xì)胞的影響很小。這表明銀杏酸對癌細(xì)胞有選擇性抑制作用。

2.2 銀杏酸與腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移腫瘤的細(xì)胞轉(zhuǎn)移涉及多個過程，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動性和侵襲能力，是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的先決條件。腫瘤轉(zhuǎn)移是復(fù)發(fā)的最主要因素，也是患者死亡的主要原因之一。同時抑制腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移也是當(dāng)前藥物開發(fā)的重要方向。

近年來，關(guān)于銀杏酸可抑制腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力的研究不斷增加。Baek等[14]發(fā)現(xiàn)銀杏酸可降低肺癌細(xì)胞的浸潤性，抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)誘導(dǎo)的A549和HI299細(xì)胞的侵襲和遷移。在銀杏酸的干預(yù)下，HepG2細(xì)胞中上皮標(biāo)志物(E-cadherin和ZO-1)的表達(dá)水平升高，間質(zhì)標(biāo)志物(波形蛋白和N-cadherin)表達(dá)水平降低[20]。相似的，在人胃癌細(xì)胞系，銀杏酸降低了ROCK1，基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)，MMP-9和α-SMA蛋白的表達(dá)水平；顯著下調(diào)了N-cadherin，Vimentin和Snail蛋白的表達(dá)水平；而E-cadherin和ZO-1蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性增加[16]。Qiao等[13]的研究表明，銀杏酸在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)了SW480細(xì)胞中侵襲相關(guān)分子的表達(dá)，包括MMP-2，MMP-9，尿激酶型纖溶酶激活物和CXC趨化因子受體4型。RAC1可驅(qū)動細(xì)胞遷移和侵襲程序。研究表明，銀杏酸抑制小GTPase RAC1的激活，損害乳腺癌細(xì)胞的侵襲性[18]。此外， Liu等[15]首次評判了銀杏酸對口腔鱗癌細(xì)胞的遷移抑制能力，實(shí)驗(yàn)表明濃度為5 μmol·L-1和10 μmol·L-1的銀杏酸對TGF誘導(dǎo)的Tca8113細(xì)胞遷移的抑制作用分別為66.3%和96.1%。目前多項(xiàng)研究已將銀杏酸侵襲及遷移抑制潛力作為抗癌新藥可開發(fā)的方向。

2.3 銀杏酸與細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束的一個完整過程。細(xì)胞凋亡是受多種基因精確調(diào)控的主動的、程序化的死亡過程[21]。通常，當(dāng)出現(xiàn)DNA突變后，細(xì)胞檢查點(diǎn)將發(fā)揮作用阻滯細(xì)胞周期，修復(fù)損傷或啟動凋亡。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡也是腫瘤藥物研究的一個重要方面。

Liu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏酸可誘導(dǎo)癌細(xì)胞G0/G1期阻滯及細(xì)胞凋亡從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，發(fā)揮抗癌作用。另有研究發(fā)現(xiàn)銀杏酸誘導(dǎo)了MDCK細(xì)胞G0/G1和G2/M期的細(xì)胞周期停滯，還加速了Tca8113和Cal-27細(xì)胞的凋亡[10,15]。同樣的，Zhou等[23]的研究表明銀杏酸可劑量依賴性將細(xì)胞阻滯在G0/G1期，通過降低Bcl-2/Bax比值來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。可見銀杏酸對G0/G1期的阻滯作用在多種細(xì)胞中得到驗(yàn)證。另外，周大宇[24]的研究表明銀杏酸C13：0可通過誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑，即下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)，來抑制三陰性乳腺癌的生長。同樣，在對胃癌的研究中，銀杏酸顯著降低了抗凋亡信號Bcl-2和Bcl-xl,而促凋亡分子Bax和Bad在mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加，顯示其發(fā)揮了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[16]，再一次證實(shí)了其潛在的抗癌活性。劉俊等[25]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，銀杏酸C17：1能調(diào)控化療細(xì)胞的自噬與凋亡，從而增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤活性，產(chǎn)生協(xié)同作用，這為化療輔助藥物的機(jī)制研究提供了一定理論依據(jù)。

3 銀杏酸抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制

3.1 作為SUMO化抑制劑發(fā)揮抗癌作用SUMO化是蛋白質(zhì)的翻譯后修飾之一，負(fù)責(zé)許多細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)，例如DNA復(fù)制和修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和核轉(zhuǎn)運(yùn)[26-27]。在SUMO化期間，SUMO蛋白通過酶促級聯(lián)共價反應(yīng)連接到靶蛋白中賴氨酸的ε-氨基，該級聯(lián)需要E1、E2和E3酶的連續(xù)作用。研究表明，不僅細(xì)胞周期和DNA修復(fù)途徑相關(guān)的許多蛋白質(zhì)是已知的SUMO化靶標(biāo)，而且許多人類腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出SUMO途徑中相關(guān)組分的顯著上調(diào)。因此，SUMOylation可能將在潛在的微環(huán)境中顯著促進(jìn)癌細(xì)胞的存活和增殖[28]。

銀杏酸可以直接與SUMO化過程中的E1酶結(jié)合并減少E1-SUMO中間體的形成，并最終抑制蛋白質(zhì)SUMOylation[29]。利用這一活性，銀杏酸在多種癌細(xì)胞中發(fā)揮抑制作用。在銀杏酸抑制SUMO化后，NOTCH1激活的乳腺癌細(xì)胞在細(xì)胞周期中進(jìn)行得更慢并最終進(jìn)入細(xì)胞凋亡[17]。Lorente等[18]發(fā)現(xiàn)銀杏酸降低了RAC1的SUMO化，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲。在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，銀杏酸通過抑制TGF-β1觸發(fā)的SMAD4的SUMO化，在體內(nèi)和體外有效抑制了腫瘤的生長和遷移[15]。在血液系統(tǒng)腫瘤方面，Iba等[30]的研究表明，銀杏酸通過發(fā)揮其SUMOylation抑制劑的作用，降低致白血病融合激酶FIP1L1-PDGFRA的穩(wěn)定性。它與伊馬替尼同用可起到協(xié)同作用，是治療FIP1L1-PDGFRA陽性的慢性嗜酸性粒細(xì)胞白血病的潛在靶標(biāo)[30]。綜上，銀杏酸可作為SUMO化抑制劑發(fā)揮抗癌作用，目前這是它在腫瘤研究中的主要機(jī)制。

3.2 其他腫瘤相關(guān)信號通路研究銀杏酸不僅作為SUMOylation抑制劑發(fā)揮作用，也可以影響其他腫瘤相關(guān)信號通路。首先，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3是一種致癌轉(zhuǎn)錄因子。銀杏酸可抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3/Janus激酶2信號通路的激活，這是通過誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生來實(shí)現(xiàn)的[16]。其次，銀杏酸消除了基礎(chǔ)PI3K/Akt/mTOR信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，減少了TGF-β誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR途徑的磷酸化[14]。除此之外，銀杏酸還可通過下調(diào)HGF/c-Met信號、激活腺苷5′-單磷酸激活蛋白激酶、減少與脂肪形成有關(guān)的關(guān)鍵酶的表達(dá)而達(dá)到抗腫瘤的效果[13,19-20]。但是這里面單個研究較多，機(jī)制尚未成熟，可參考價值略小。

4 總結(jié)與展望

自1997 年銀杏酸被單獨(dú)分析以來，科學(xué)家們對它的多種活性進(jìn)行了研究，可以說是一種生物活性非常廣泛的酚酸類小分子化合物。近五年來，銀杏酸的抗腫瘤活性是其中的研究熱點(diǎn)，在胃癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌以及乳腺癌等領(lǐng)域均有所報道。

從功能上來看，銀杏酸主要通過抑制腫瘤生長增殖，抑制腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移，阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等實(shí)現(xiàn)抗腫瘤的效果，并在大部分的文章中得到了驗(yàn)證。在機(jī)制方面，銀杏酸作為SUMO化抑制劑在部分研究中起到關(guān)鍵作用。但是其他的腫瘤相關(guān)機(jī)制研究就比較分散，多為單篇報道，因此說服力較小。銀杏酸本身具有致敏性，這一點(diǎn)在多篇文章中均有闡述，實(shí)際上對銀杏酸的藥用價值研究來說這是一個需要解決的問題。另外，銀杏酸具有潛在肝腎毒性，這可能成為阻礙其藥物開發(fā)利用的關(guān)鍵問題。然而目前關(guān)于其代謝及毒理學(xué)方面資料不多，還需更加全面深入的研究探討。雖然有關(guān)銀杏酸抗腫瘤活性的相關(guān)研究近幾年才慢慢開始，研究數(shù)據(jù)還較少。但是，從目前來看，這些研究基本上都有比較深入的探索，比較完整的實(shí)驗(yàn)，內(nèi)容較為豐富，從中我們可以看到銀杏酸的抗癌能力，這讓它作為一種潛在抗癌藥物具有很好的研究價值和研發(fā)前景。另外，現(xiàn)如今表觀遺傳機(jī)制在腫瘤生長發(fā)展中的研究已經(jīng)吸引了越來越多的目光，銀杏酸作為SUMOylation抑制劑，相信在此領(lǐng)域有價值的科研成果會不斷被發(fā)現(xiàn)，從而使其作為抗癌新藥研發(fā)的潛在候選藥物受到關(guān)注。