青海不同海拔地區(qū)小麥種子萌發(fā)過程中α-淀粉酶活性差異比較

王麗，權(quán)有娟，李想，劉德梅，陳志國

（1中國科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧 810008；2青海大學(xué)，西寧 810016；3中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4中國科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點實驗室，西寧 810008；5青海省作物分子育種重點實驗室，西寧 810008）

0 引言

小麥?zhǔn)鞘澜缟戏N植面積最大、種植時間最早、分布最廣、產(chǎn)量最高的糧食作物之一[1-2]，也是中國主要的栽培農(nóng)作物。小麥作為三大谷物之一，在田間必須要密集型種植[3]，發(fā)芽率過低會直接導(dǎo)致田間群體降低，不利于增產(chǎn)[4]。影響小麥發(fā)芽率的因素有很多，如貯存條件[5]、籽粒的發(fā)育成熟階段、籽粒的感病情況、機(jī)械損傷、籽粒水分含量等[6]。同時，小麥種子萌發(fā)還與萌發(fā)相關(guān)酶有關(guān)[7]。種子萌發(fā)相關(guān)酶主要有α-淀粉酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶等[8]。

小麥在萌發(fā)過程中，首先是種子吸水膨脹，種子呼吸作用加劇，接著是種皮變軟，胚根最先生長，突破種皮向下生長成為主根，接著是胚軸與胚芽的生長，最后形成莖和葉[9]。在種子萌發(fā)這個復(fù)雜過程中，營養(yǎng)物質(zhì)的大量消耗是不可避免的一個過程，而萌發(fā)的種子中最主要的營養(yǎng)物質(zhì)便是儲存在胚乳中的淀粉[10]，通常需要淀粉酶將淀粉分解使之成為小分子糖類，以供種子萌發(fā)使用[11]。植物中的淀粉酶有α-淀粉酶和β-淀粉酶兩種，其中α-淀粉酶是最主要的萌發(fā)相關(guān)酶[12]，可以將胚乳中的淀粉水解為糖，供胚生長[13]。

青海柴達(dá)木盆地高海拔地區(qū)具有大氣干潔、光照充分、晝夜溫差大等特殊生態(tài)條件[14]，近年來成為青海省東部農(nóng)業(yè)區(qū)小麥良種重要的繁育基地，但在生產(chǎn)實踐中，多次出現(xiàn)盆地生產(chǎn)的種子發(fā)芽率低，造成田間出苗差的現(xiàn)象，成為困擾種子生產(chǎn)企業(yè)的重大問題。通過青海省東部農(nóng)業(yè)區(qū)海東市樂都區(qū)以及柴達(dá)木盆地都蘭縣香日德地區(qū)兩地收獲的種子進(jìn)行水分、千粒重測定，和α-淀粉酶活性的測定，試圖找出青海東部和柴達(dá)木盆地之間小麥種子發(fā)芽率的差異的原因。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選用同一年份青海省海東市樂都區(qū)（海拔1956 m）和柴達(dá)木盆地都蘭縣香日德地區(qū)（海拔2990 m）生產(chǎn)的‘高原437’、‘青麥1 號’、‘高原448’、‘青春38’等4個主栽品種種子共8份材料。對這4個品種在兩地收獲的種子進(jìn)行為期7 天的發(fā)芽實驗，對α-淀粉酶的活性進(jìn)行了測定。

材料準(zhǔn)備：每個品種從剛收割脫粒的大田小麥中經(jīng)過精選去除雜質(zhì)后1 kg 混勻，置于室溫干燥儲藏。實驗在青海省作物分子育種重點實驗室，于2018年12月—2019年2月開展。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子水分及千粒重測定 參照GB/T 3543—1995.4《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》[15]有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對8 份受試材料進(jìn)行千粒重測定，利用波通公司產(chǎn)Perten DA 7250型近紅外分析儀進(jìn)行水分測定。

1.2.2 發(fā)芽實驗根據(jù)GB/T 3543—1995.4《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》的要求，采用TP發(fā)芽紙法[16]。將8份受試材料每份分出300 粒完整無損傷種子，置于培養(yǎng)皿中用75%酒精進(jìn)行消毒處理30 s，處理后用蒸餾水反復(fù)漂洗3 次，再用自來水浸泡種子24 h，略微晾干，將兩層發(fā)芽紙置于發(fā)芽盒(12 cm×12 cm×6 cm)內(nèi)，將種子整齊均勻排列在發(fā)芽紙上，每盒放置100 粒種子（10 ?！?0 粒），3 次重復(fù)。用蒸餾水（約12 mL）浸潤發(fā)芽紙(12 cm×12 cm)，加蓋，置于人工氣候箱(25℃)內(nèi)，在控溫條件下發(fā)芽。置床后的第1天至第7天每日早晨統(tǒng)計發(fā)芽情況，計算發(fā)芽率和發(fā)芽勢[17-18]，見公式(1)和(2)。

1.2.3 總蛋白含量測定采用南京建成生物工程研究所研制的BCA 法蛋白定量測試盒，利用PerkinElmer Enspire型酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光值測量。

方法：準(zhǔn)確稱取0.2 g樣品小麥種子，按照重量(g):體積(mL)=1:9的比例加入1.8 mL勻漿介質(zhì)（0.2 mol/L，pH 7.8 的磷酸緩沖液），冰水浴條件下制備成10%的組織勻漿液，4℃，3500 r/min 離心10 min，取上清液待測。

將各樣品混勻，37℃孵育30 min，波長562 nm，酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值?？偟鞍诐舛鹊挠嬎阋姽?3)。

表1 總蛋白含量測定操作表

測得10%小麥組織勻漿蛋白濃度為1.92mgprot/mL。

1.2.4α-淀粉酶(AMS)活性測定發(fā)芽實驗第1～7 天，每日清晨準(zhǔn)確稱取0.2 g 小麥種子，加入勻漿介質(zhì)，制備組織勻漿，4℃，3500 r/min離心10 min，取上清液，按上清液：勻漿介質(zhì)=1:1稀釋酶液，取稀釋后酶液進(jìn)行操作。采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的淀粉酶測試盒進(jìn)行α-淀粉酶活性測定。

試劑一：0.4 mg/mL底物緩沖液

試劑二：0.1 mol/L碘儲備液

0.01mol/L碘應(yīng)用液的配制：按照碘儲備液：雙蒸水=1:9稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配，4℃遮光保存。

加樣完畢后，取樣200 μL 加入96 孔板，置于酶標(biāo)儀下測定吸光值。α-淀粉酶(AMS)活性計算見公式(4)。

表2 α-淀粉酶活性測定操作表

1.2.5 數(shù)據(jù)處理實驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0和Excel進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有圖片均是由Microsoft Excel 制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 受試材料的千粒重以及水分含量的測定

在種子萌發(fā)期間吸水膨脹，水分含量對于種子的萌發(fā)存在影響：隨著水分含量的下降，種子的萌發(fā)率呈升高趨勢[19]，由表3知，8份受試材料千粒重在31～46 g之間，屬于正常水平，由于氣候條件差異，都蘭地區(qū)收獲的小麥種子千粒重明顯高于樂都地區(qū)。8份受試材料水分均在13%以下，符合小麥貯藏規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，兩地之間種子水分含量差異不大，說明水分不是造成地區(qū)之間種子發(fā)芽率差異的主要原因。

表3 受試材料的千粒重及水分含量

2.2 受試材料的發(fā)芽率及發(fā)芽勢

種子的發(fā)芽勢表示的是種子發(fā)芽的整齊度，是衡量種子品質(zhì)的指標(biāo)之一[20]。由表4得知，8份受試材料發(fā)芽情況各不相同，其中發(fā)芽率最高的是‘青春38’（樂都點），為96.33%。其次為‘高原437’（樂都點）、‘青麥1 號’（樂都點），分別為94.67%、92.67%。而都蘭點生產(chǎn)的‘青麥1號’、‘青春38’、‘高原437’、‘高原448’發(fā)芽率偏低，分別為76.67%、75.33%、70.33%、31.00%。樂都點芽率最低的‘高原448’也達(dá)到了79.33%。低海拔的樂都點較高海拔的都蘭點芽率差異明顯。

各材料7 天內(nèi)的具體發(fā)芽情況為：都蘭地區(qū)收獲種子，包括‘高原448’、‘青麥1號’、‘高原437’、‘青春38’在7天內(nèi)整體發(fā)芽率一直呈現(xiàn)緩慢的增長趨勢，直至發(fā)芽實驗最后1 天仍然未達(dá)到正常的發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，整體發(fā)芽率與對應(yīng)的樂都地區(qū)的種子比較相對要低得多，尤其是‘高原448’，最后的發(fā)芽率只為31.00%。相比而言，樂都地區(qū)收獲的種子，發(fā)芽情況比較一致，表現(xiàn)在第1天均有少量種子發(fā)芽，自第2天到第3天發(fā)芽率呈現(xiàn)迅猛增長，到第4天，發(fā)芽率基本達(dá)到最大值并保持平衡。

發(fā)芽勢比較，‘高原448’（樂都）發(fā)芽勢最高，為75.67%，其次是‘高原437’（樂都）、‘青春38’（樂都），分別為74.33%，74.00%。樂都地區(qū)發(fā)芽勢普遍高于都蘭地區(qū)。

實驗表明，同一品種在都蘭和樂都地區(qū)種子發(fā)芽率差異十分懸殊，發(fā)芽率對于小麥的群體構(gòu)建具有重要的影響，也是影響小麥高產(chǎn)的一個重要因素之一。

表4 受試材料的發(fā)芽率

2.3 兩地材料α-淀粉酶活性差異比較

α-淀粉酶是小麥萌發(fā)過程中最主要的淀粉水解酶。研究表明，α-淀粉酶活性與小麥發(fā)芽率呈極顯著的相關(guān)性[21]。受試材料在發(fā)芽前1～3天，α-淀粉酶活性呈現(xiàn)出迅速增加趨勢，至第3 天以后達(dá)到最大值并保持基本穩(wěn)定（表5）。由圖1 可知，在整個萌發(fā)過程中，樂都種子內(nèi)的α-淀粉酶活性均呈現(xiàn)出略高于都蘭地區(qū)種子的趨勢。

經(jīng)SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析，本實驗中8份受試材料的α-淀粉酶活性與發(fā)芽率顯著相關(guān)，皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.641，呈顯著相關(guān)性，與晏本菊[21]的研究一致。樂都地區(qū)生產(chǎn)的種子萌發(fā)期α-淀粉酶活性略高于都蘭地區(qū)生產(chǎn)的種子，但是二者之間差異并不顯著。

3 討論與結(jié)論

小麥種子萌發(fā)是一個復(fù)雜而又精細(xì)的過程，小麥發(fā)芽率是小麥種子活力檢測的一個常用指標(biāo)[22]，也是評價小麥種子儲藏劣變的一個敏感指標(biāo)[23]。種子發(fā)芽率與種子的成活率密切相關(guān)，并且直接影響種子的質(zhì)量[24]，關(guān)系到大田成苗。

表5 受試材料萌發(fā)期α-淀粉酶活性

本實驗中對8份受試材料發(fā)芽率、水分含量、α-淀粉酶活性等指標(biāo)進(jìn)行了分析測定，8 份材料的水分含量均在8%左右，無明顯差異，符合安全儲存標(biāo)準(zhǔn)，因此排除水分含量是造成兩地發(fā)芽率顯著差異的原因。雖然儲藏條件、真菌感染等也會對發(fā)芽率產(chǎn)生影響[25]，但都蘭地區(qū)干燥少雨，真菌病害極輕，從籽粒表觀來看，都蘭產(chǎn)的小麥種子籽粒飽滿度好，色澤亮麗，完全達(dá)到小麥良種一級要求（除芽率以外）的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)，所以也排除了儲藏條件、真菌感染造成青海兩地發(fā)芽率顯著差異的原因。

通過α-淀粉酶活性測定及比較，得出樂都地區(qū)生產(chǎn)的種子α-淀粉酶活性略高于都蘭地區(qū)的種子，但是二者之間差異并不顯著，所以推測α-淀粉酶活性可能是造成兩地區(qū)種子發(fā)芽率顯著差異的一個方面因素。但該地區(qū)小麥生長后期常遇低溫凍害，對小麥籽粒成熟度，特別是胚的成熟度有一定的影響，這可能是造成都蘭地區(qū)小麥籽粒芽率偏低的另外一個原因。本研究只對小麥種子水分含量、α-淀粉酶活性進(jìn)行了探討，但發(fā)芽率的差異是多種因素作用的結(jié)果，對其他萌發(fā)相關(guān)酶以及胚的成熟度等方面的因素還需要進(jìn)一步的探討。