利用重組自交系高密度遺傳圖譜定位水稻芽期耐冷QTL

劉睿琦 ，鄒安東，吳光亮,2，王鵬,2，李才敬,2，張翔宇,2，程琴,2，王燕寧,2，黃詩穎,2，賀浩華,2,3，邊建民,2,3

（1江西農業大學/作物生理生態與遺傳育種教育部重點實驗室，南昌 330045；2江西省水稻高水平工程研究中心，南昌 330045；3江西農業大學/作物生理生態與遺傳育種江西省重點實驗室，南昌 330045）

0 引言

水稻是世界重要的糧食作物之一，水稻高產與穩產對于保障世界糧食安全具有重要作用[1]。水稻起源于熱帶和亞熱帶地區，是一種喜溫作物，對低溫較為敏感。低溫冷害是水稻生長的主要限制因子之一，是世界上水稻主產區普遍面臨的問題。長期低溫脅迫會導致水稻出現死苗、減產及品質下降等現象，對水稻安全生產造成了嚴重威脅[2-3]。根據冷害發生的時期，可將水稻冷害主要劃分為芽期冷害、苗期冷害、孕穗期冷害、開花期冷害和灌漿期冷害[4]。其中，芽期冷害是指水稻從播種至第一片完全葉期間受到低溫影響，導致出芽時間延長或爛種，嚴重影響產量。這個時期又可分為發芽期和芽期，發芽期耐冷性是水稻種子在低溫下的萌發能力，而芽期耐冷性是指水稻種子萌發后，在低溫下長成綠苗的能力[5]。芽期耐冷性是水稻生長早期重要抗逆指標之一，水稻芽期耐冷性強弱，不僅決定著水稻能否在生長前期早生快發，而且對水稻后期生長起著較為關鍵的作用[6-7]。因此，尋找水稻芽期耐冷性QTL，對于解析水稻耐冷分子遺傳基礎、培育耐冷水稻品種具有重要作用。

近年來，隨著分子生物學技術發展，水稻耐冷性QTL 定位研究逐漸增多。利用不同水稻遺傳群體和不同耐冷性鑒定方法，定位了多個耐冷相關的QTL。其中，以種子發芽率或成苗率作為鑒定指標，定位了至少99 個芽期耐冷性QTL[8]。Miura 等[9]利用‘Nipponbare’/‘Kasalath’回交構建的回交自交系(BIL)群體，檢測到5個芽期耐低溫QTL，貢獻率均達到10%以上。Zhang等[10]和陳瑋等[11]利用‘Lemont’/‘特青’構建的RILs群體，通過卷紙法將芽期耐冷的QTL定位在第1、3、7、11 染色體上，其中LOD 值最大的QTL 位于11號染色體，命名為qSCT-11，可用于水稻芽期耐冷性遺傳改良。Baruah 等[12]利用RILs 群體把粳稻‘Hokkaido’芽期耐冷性QTL定位在第1、5、11和12等染色體。張露霞等[13]以‘Asominori’/‘IR24’構建的RILs群體和染色體片段置換系為材料，以芽期死苗率為耐冷性評價指標，檢測到3個芽期耐冷性QTL，分別命名為qCTBP-5-1、qCTBP-5-2和qCTBP-12，且芽期耐冷等位基因均來自于粳型耐冷親本‘Asominori’。朱金燕等[14]以‘陸矮4 號’為受體親本、‘日本晴’供體親本的單片段代換系(SSSLs)為材料，共檢測到8個芽期耐冷QTL，分布在水稻第1、6、8、9 和10 號染色體。Zhao等[15]以‘東鄉野生稻’為供體構建的159個片段代換系(CSSLs)為材料，檢測到7個耐冷性QTL，并鑒定1株極耐寒株系‘SIL157’。隨著研究的深入，QTL間的上位性研究逐漸增多，研究表明上位性效應在水稻耐冷遺傳中也起著重要作用[16]。楊洛淼等[17]利用以粳稻品種‘東農422’為母本，耐冷品種‘空育131’為父本，衍生構建的190個F6和F7株系為試驗材料，對水稻發芽期、芽期、苗期和孕穗期進行了耐冷鑒定，共檢測到33對上位性QTL，其中12對上位性效應為負，22對表現為正，貢獻率介于0.41%～13.54%之間，其中有11 對有加性QTL 參與互作。曲婷婷等[18]以水稻秈粳交（‘圭630’/‘02428’）構建的加倍單倍體(DH)群體為材料，檢測到8 個控制水稻苗期耐冷性的上位性互作位點，分布在水稻第2、7、8、9和11染色體。Zhang等[10]利用秈粳交（‘Lemont’/‘特青’）構建的包含269 個家系的RILs群體為材料，檢測到9個上位性互作位點，每個上位性位點對水稻幼苗耐冷性的影響都很小，但所有互作位點絕對上位效應總和達36%，說明上位效應在幼苗耐冷性遺傳控制中的重要性。

然而，水稻耐冷性是受多基因控制的復雜數量性狀，傳統水稻芽期耐冷性QTL定位多采用秈粳交后代群體，定位的芽期耐冷QTL等位基因較多來自粳型品種。由于遺傳分化差異，粳稻耐冷QTL很難在短期內通過分子標記技術轉育到秈稻中，來提高秈稻耐冷性，在很大程度上限制了秈稻耐冷性分子育種。因此，挖掘秈稻中耐冷QTL（基因），對于利用分子標記技術改良秈稻耐冷性有重要作用。基于此，本研究利用雙季稻區種植較為廣泛的超級稻品種‘五豐優T025’雙親‘五豐B’和‘昌恢T025’為材料，構建了包含124 個家系的RILs 群體，并對水稻芽期耐冷性進行QTL 分析，以期挖掘其中芽期耐冷QTL，為秈稻特別是雙季稻秈稻芽期耐冷性育種提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

‘五豐優T025’是長江中下游種植比較廣泛的超級雜交晚稻品種[19]。本研究以‘五豐優T025’的雙親‘五豐B’和‘昌恢T025’為材料，構建了包含124 個家系的RILs群體。

1.2 基因分型和遺傳連鎖圖譜的構建

提取‘五豐B’、‘昌恢T025’和124 個家系的基因組DNA，利用物理法斷裂DNA 并構建～300 bp 的文庫；利用華大基因MGISEQ-2000設備對構建的文庫進行測序；基于測序結果對其中表現多態性標記的SNP進行篩選；將連續多個SNP標記且具有相同的基因型概括為一個bin 標記[20]；最后利用獲得的bin 標記結合JoinMap 4.2 軟件構建了‘五豐B’和‘昌恢T025’雜交衍生的RILs群體高密度連鎖圖譜。

1.3 芽期耐冷性鑒定

從親本和RILs 群體每個家系中各挑選籽粒飽滿完整且無病蟲害的種子40粒，置于墊有濾紙的培養皿中，加少量水于25℃下浸種1～2天，然后挑選長勢基本相同的露白種子30 粒，加少量水，放入10℃低溫恒溫箱進行低溫處理7 天。低溫處理結束后，從低溫恒溫箱取出，將材料放入25℃的人工氣候室恢復生長7天。恢復后第7 天后測量根數、根長和芽長及幼芽存活率。恢復期間，每天換水保證水分充足。實驗重復3次，求其平均數進行分析。

1.4 QTL分析

采用IciMapping V4.2 軟件對RILs 群體進行數據分析和QTL定位，LOD的閾值設為2.5，當測定LOD值大于2.5時，則判定該區段存在一個QTL，并同時測定貢獻率與加性效應。加性效應正值表明耐冷性的等位基因來自于親本‘五豐B’，負值則表示來源于親本‘昌恢T025’；LOD的閾值為5.0 判斷是否有互作效應，當測定LOD值大于5.0時，則判定存在互作效應，并同時測定貢獻率與上位性效應。QTL 的命名遵循McCouch 等[21]提出的原則。用SPSS22 軟件與Microsoft Excel 2017內置公式進行顯著性分析。

2 結果和分析

2.1 遺傳圖譜構建

對測序的數據進行分析，獲得高質量的SNP 701,310 個。對獲得SNP 進行bin 轉換，經過嚴格篩選，最終獲得均勻分布在12條染色體上2578個bin標記，平均每條染色體包含214.8個bin標記。其中，標記最少的是8號染色體，有159個bin標記，標記最多的是1號染色體，有303個bin標記（表1）。進一步利用這些bin標記分析124個家系構建了高密度遺傳圖譜，該圖譜總距離為1762.8 Mb（圖1）。其中，2個相鄰標記之間的平均距離為0.70 Mb，12 號染色體的平均距離最小，為0.58 Mb，8號染色體上的平均距離最大，為0.92 Mb。

2.2 芽期耐冷性的表型分析

如表2 所示，10℃低溫處理后，‘五豐B’根長和根數顯著大于‘昌恢T025’；‘五豐B’種子芽長大于‘昌恢T025’，差異不顯著；‘昌恢T025’和‘五豐B’幼苗存活率相同，均為100%。表明在低溫脅迫下，‘五豐B’長勢要好于‘昌恢T025’。

10℃低溫處理后，RILs 群體根長、芽長、根數和存活率均表現出不同程度差異（表2）。RILs群體偏度及峰度均小于1，表明RILs群體根長、芽長和根數表現為近似連續正態分布，并存在明顯的超親分離現象（表2，圖2）。表明‘五豐B’和‘昌恢T025’衍生的RILs 群體在芽期10℃低溫處理后，幼芽的根長、芽長和根數這3 個性狀均表現出典型的數量性狀遺傳，符合QTL 定位要求。

表1 染色體標記信息及遺傳距離信息

2.3 相關性分析

利用SPSS 22軟件對RILs群體芽期10℃冷處理后的根長、芽長、根數和存活率進行相關性分析。結果顯示，根長和芽長在10℃低溫處理后存在極顯著的正相關，相關系數為0.39；芽長和根數在10℃低溫處理后存在極顯著的正相關，相關系數為0.23（表3）。表明該RILs 群體在10℃低溫處理后，根長和芽長，芽長和根數之間存在聯系。

2.4 水稻芽期耐冷性的加性QTL分析

采用QTL Icimapping v4.2 軟件進行QTL 分析，共檢測到3 個控制芽期耐冷性的QTL，別是qRL1、qRL2和qBL6。其中，qRL1、qRL2控制根長，qBL6控制芽長。這些QTL 分別位于水稻第1、第2 和第6 染色體，LOD值分別為2.98、2.51和5.26，可解釋的表型變異率在8.67%～14.04%之間，3個QTL增效等位基因均來自于親本‘昌恢T025’。本研究未檢測到控制存活率和根數加性QTL（表4，圖3）。

2.5 水稻芽期耐冷上位性QTL分析

本研究共檢測出13 對水稻芽期耐冷上位性互作QTL（表5，圖4）。其中以低溫處理后水稻芽長作為耐冷鑒定指標，檢測到第3染色體和第8染色體之間存在上位性互作，其LOD值為5.21，上位性效應為-0.24，貢獻率為21.77%。以低溫處理后水稻存活率作為耐冷

表2 芽期耐冷在親本和RILs群體中的分布情況

表3 RILs群體芽期10℃低溫處理后種子性狀的相關性分析

表4 水稻芽期耐冷性的QTL定位及遺傳效應

鑒定指標，共檢測到12 對上位性互作QTL，LOD 值在29.84～41.24 之間，上位性效應在0.23～0.26 之間，貢獻率在4.68%～4.76%之間。以低溫處理后水稻根長和根數作為水稻耐冷性鑒定指標，未檢測到上位性互作QTL。

表5 水稻芽期耐冷性的上位性效應位點

3 討論與結論

低溫冷害是影響水稻生長發育的重要因素之一。水稻芽期冷害會造成死苗或爛秧，影響水稻生長和成熟，最終導致水稻產量虧損，所以提高水稻芽期耐冷性是水稻高產的必然要求。從國內外研究可知，水稻耐冷性是受多基因控制的復雜數量性狀遺傳，利用不同的研究群體定位了多個水稻耐冷相關的QTL[8]。但是，芽期耐冷相關QTL 定位的數量相對較少[22-25]。因此，定位更多的影響水稻芽期耐冷QTL對于解析水稻芽期耐冷遺傳機理并進行水稻分子育種具有重要作用。

本實驗共檢測出3 個控制芽期耐冷性QTL，分別位于水稻第1、2和6染色體。通過比較發現，戴陸園[26]以‘昆明小白谷’與‘日本晴’構建NILs 群體定到的生殖期耐冷QTLqRCT6b與本研究定位的qBL6（物理位置：chr6:3.9478 Mb～4.0048 Mb）位置接近。目前暫未發現與qRL1（物理位置：chr1:0.6751 Mb～0.742 Mb）和qRL2（物理位置：chr2:18.1933～18.3025 Mb）相同或接近的水稻耐冷QTL。這2個QTL可能是水稻芽期耐冷新位點，需后續進一步深入探究，結果對于解析水稻芽期耐冷遺傳機理并進行水稻芽期耐冷改良具有重要指導作用。此外，本研究未檢測到控制存活率和根數加性QTL，很可能是由于控制兩個性狀的位點效應較小。

一般而言，粳稻品種芽期耐冷性普遍強于秈稻品種[27]，通過秈粳交分離群體，也定位了來源于粳稻品種的耐冷QTL[8]。而關于秈稻間耐冷性差異研究較少，限制了筆者對不同秈稻品種耐冷性遺傳基礎的了解。本實驗以2個不同秈稻品種‘五豐B’和‘昌恢T025’進行研究，發現秈稻之間也存在耐冷性的差異，同時檢測到了3 個水稻芽期耐冷性QTL，其增效等位基因均來自冷敏型秈稻恢復系‘昌恢T025’。類似的研究結果在前人的實驗中也有提及，如張露霞等[13]利用‘Asominori’/‘IR24’構建的RILs和染色體片段置換系為材料，以芽期死苗率為耐冷性評價指標，鑒定出2個來自秈稻品種‘IR24’對芽期耐冷性的增效等位基因。王棋[28]以‘瀘恢99’和‘沈農265’雜交衍生的重組自交系為材料，以低溫條件下水稻發芽率和苗期葉片赤枯度為耐冷性鑒定指標，檢測到的qLTG-5和qSCT-9，其耐冷增效等位基因均來源于秈稻品種‘瀘恢99’。這些結果表明秈稻中也蘊藏著耐冷基因(QTL)，因此，挖掘秈稻耐冷基因(QTL)對于利用分子標記技術進行耐冷基因(QTL)聚合育種提高秈稻耐冷性具有重要作用。‘昌恢T025’作為江西等雙季稻區比較有代表性的秈稻恢復系品種，可以利用‘昌恢T025’作為中間材料，進行連鎖分子標記，通過分子標記輔助選擇技術將這些芽期耐低溫的主效QTL轉入其他秈稻品種中，提高秈稻品種的芽期耐低溫能力。此外，盡管本研究通過構建的高密度遺傳圖譜已將3個控制水稻芽期耐冷性的QTL定位在很小的染色體區間，但是由于重組自交系群體背景復雜，很難在短期內將其中耐冷QTL分離克隆，因此有必要構建近等基因系來分離并克隆這些水稻芽期耐冷性QTL，為解析秈稻耐冷遺傳機理和后期利用這些QTL 進行分子標記輔助選擇育種奠定基礎。

上位性互作是數量性狀遺傳的重要組成部分，上位性互作對解析復雜性狀的遺傳基礎具有十分重要的意義[29-32]。本實驗以低溫處理后的芽長為耐冷鑒定指標，檢測到第3染色體與第8染色體之間存在上位性互作，其貢獻值最大，為重組型大于親本性互作。此外，每條染色體上都檢測到一對低溫脅迫下影響水稻芽期存活率上位性互作位點，并且位點相鄰。而未檢測到與根長和根數相關的上位性互作位點。表明在水稻芽期，上位性互作位點可能在調控水稻低溫脅迫起了重要作用。關于芽期耐冷上位性效應研究涉及較少，所以發掘上位性互作新位點并分析位點間上位性互作和估算其效應，可以進一步了解芽期耐冷的遺傳基礎及為輔助育種提供依據。

本研究以雙季超級稻品種‘五豐優T025’雙親‘五豐B’和‘昌恢T025’雜交衍生的重組自交系群體為材料，對水稻幼芽耐冷性進行了分析，結果顯示水稻芽期耐冷性是由數量性狀位點控制的。結合高密度連鎖圖譜，檢測到3 個控制芽期耐冷性主效QTL，其中qBL6可能與已報道的基因是同一基因或等位基因，而qRL1和qRL2所在染色體位置目前尚未有耐冷QTL的報道，可能是控制芽期耐冷的新位點。這些耐冷QTL 定位對于后續克隆秈稻耐冷基因解析秈稻耐冷遺傳機制奠定了基礎。此外，本研究檢測到13對影響水稻芽期耐冷上位性互作QTL，說明上位性互作效應在調控水稻芽期耐冷過程中起著重要作用。