惡性胸膜間皮瘤中EFEMP1基因mRNA的表達及其臨床病理學意義

楊娜，李彬，李素芬，王唯斯，自加吉，熊偉，2

1.大理大學 基礎醫學院 a.生物化學與分子生物學教研室；b.病理學教研室；云南 大理 671000；

2.云南省高校臨床生物化學檢驗重點實驗室，云南 大理 671000

惡性胸膜間皮瘤（malignant pleural mesothelioma，MPM）是一種來源于胸膜間皮細胞的原發腫瘤，占胸膜腫瘤的5%，臨床少見[1]。胸膜間皮瘤可發生于臟層胸膜和壁層胸膜的任何部分，80%發生于臟層胸膜，20%發生于壁層胸膜；可發生于任何年齡，常見于40～60歲[1]。胸膜間皮瘤是由環境、生物和遺傳因素引起的腫瘤。石棉已被國際癌癥研究中心（IARC）確定為致癌物[2]，在美國和西方國家石棉被認為是導致惡性間皮瘤的主要原因。在不同國家，MPM的發病率差異較大，國外以澳大利亞最高，發病率約為3.54/10萬，國內每年發病率為0.3/10萬～0.5/10萬，以云南省最高，約為8.5/10萬～17.75/10萬[3-4]。目前對該病的診斷及治療較棘手，早期診斷可以提高MPM患者的生存率，一些用于早期診斷的分子標志物如間皮素（mesothelin），癌胚抗原（CEA），糖類抗原CA125、CA153、CA199和細胞表明標志物CD90等的敏感性和特異性均有限[5]。目前，MPM的診斷金標準仍為胸腔鏡活檢，缺乏較為便捷有效且低痛苦的診斷方法，發掘新的MPM診斷方法能夠為患者的早期診斷和治療提供依據。

人表皮生長因子含纖蛋白樣胞外基質蛋白1（epidermal growth factor containing fibulin like extracellular matrix protein 1，EFEMP1）基因定位于染色體2p16.1，含有12個外顯子，編碼產物為纖蛋白3（fibulin 3）[6]。纖蛋白家族共7個成員，纖蛋白3含有493個氨基酸殘基，在不同物種中高度保守，在人類、大鼠和小鼠中92%～94%的氨基酸序列同源。纖蛋白3是一種細胞外糖蛋白，廣泛分布于發育中的組織與成熟組織中，在生理條件下通常以單體形式存在。研究發現，纖蛋白3在MPM患者的血漿和胸水中水平顯著升高，且敏感性和特異性較高[7-8]。目前，EFEMP1基因表達與MPM發生發展的關系尚不明確。因此，本研究旨在闡明EFEMP1基因mRNA在MPM組織中的表達情況，并進一步探討其與臨床病理參數及患者預后的相關性。

1 材料與方法

1.1 利用Oncomine數據庫分析EFEMP1基因mRNA在MPM組織與非腫瘤組織中的表達

Oncomine數據庫是目前最大的腫瘤基因芯片整合平臺和分析平臺，可用于對目標基因的篩選及該基因在不同組織中的表達分析。本研究在Oncomine數據庫中設置條件為：①“Gene：EFEMP1”；②“Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis”；③“Cancer Type：Other Cancer-Mesothelioma-Pleural Malignant Mesothelioma”；④“Simple Type：Clinical Specimen”。對纖蛋白3在MPM組織與非腫瘤組織中的表達差異進行分析。

1.2 下載TCGA數據庫中MPM數據集的病理資料與患者預后資料

使用R3.6.3軟件，利用Epicalc函數包，從美國公共癌癥基因數據庫（The Cancer Genome Atlas，TCGA）（http://tcga-adtaa.nci.nih.gov/tcga/）中 下載并預處理MPM數據集中EFEMP1基因mRNA表達量的數據集，同時下載MPM患者的臨床病理參數和預后資料，將2個數據集根據對應的TCGA病例編號進行合并。

1.3 對TCGA數據庫中MPM數據集進行篩選及病理相關性分析

通過R3.6.3下載合并得到的數據集meso_tcga中包含87例MPM病例樣本。通過對臨床數據進行篩選比對，刪除缺失數據及無效數據，僅保留完整有效的數據82例。根據RNA測序結果分析，MPM樣本中EFEMP1基因表達量為1646.753～115 390.589，中位表達量為28 250.071。以中位表達量為截斷值，樣本中EFEMP1表達量高于中位數的定義為高表達（high），反之為低表達（low），2組均為41例。

1.4 MPM組織的病理學分型

TCGA數據庫中MPM數據集將MPM組織的病理學分型分為3種，即肉瘤樣型（Sarcomatoid Type）、上皮樣型（Epithelioid Type）和雙向混合型（Biphasic Type），依次分別包括2例、57例、23例。

1.5 EFEMP1基因mRNA表達水平對MPM患者預后的影響

采用基因表達譜動態分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）（http://gepia.cancer-pku.cn）數據庫對數據構建Kaplan-Meier模型，探究EFEMP1基因mRNA表達水平與MPM患者預后之間的關系。

1.6 EFEMP1基因mRNA表達水平與其他基因表達的相關性分析

cBioportal（http://www.cbioportal.org/）是基于公共數據庫研究分析癌癥基因數據的可視化工具，通過自定義數據探求基因改變和臨床之間的聯系，并使其可視化。選擇MPM組織和EFEMP1基因，可得出MPM中EFEMP1基因與其他基因表達的相關性可視化分析圖。

1.7 統計學分析

建立MPM患者的臨床病理數據集，將患者年齡、性別、AJCC病理分期、T分期、M分期、N分期、病理類型、組織學診斷和EFEMP1基因mRNA表達量進行量化賦值。采用R3.6.3和Graphpad Prism 8.0進行統計學分析及繪圖，使用Shapiro-Wilk方法檢測MPM組織中EFEMP1基因mRNA表達量的正態分布情況，結果顯示EFEMP1基因mRNA表達量不符合正態分布（P＜0.05）。因此，MPM組織的EFEMP1基因mRNA表達量比較采用Mann-Whitney U非參數檢驗。組間比較采用χ2檢驗及Fisher精確概率法進行臨床病理參數相關性分析?；颊哳A后分析采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并進行Logrank檢驗。采用Pearson或Spearman法進行基因表達的相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 EFEMP1基因mRNA在MPM組織中的表達量顯著高于正常組織

對Oncomine基因芯片數據庫數據篩選分析，所得結果顯示在正常組織以及有關MPM的共54個樣本中，與正常肺組織和正常胸膜組織相比，EFEMP1基因在MPM組織中的表達量顯著升高，且組間差異極顯著（P＜0.01），結果如圖1。

2.2 MPM組織中EFEMP1基因mRNA表達量與臨床病理參數的相關性

圖1 正常組織與MPM組織中EFEMP1基因mRNA表達量差異

從TCGA數據庫下載并整理得到臨床病理參數完整的82例MPM病例資料，其中女性16例、男性66例，年齡28.0～81.0歲，中位年齡64.0歲。對該數據集中MPM患者預后的各影響因素進行賦值，通過統計學分析得知MPM組織中EFEMP1基因mRNA低表達41例、高表達41例。結果表明，EFEMP1基因mRNA表達量與MPM患者的T分期（P=0.046）、病理類型（P=0.031）及組織學診斷類型（P=0.031）存在顯著相關性，而與患者的年齡、性別、N分期、M分期、AJCC病理分期均無顯著相關性（均P＞0.05）。結果見表1。

2.3 EFEMP1基因mRNA表達量與MPM患者的預后無顯著相關性

用GEPIA數據庫構建Kaplan-Meier生存曲線并進行Logrank法檢驗，結果表明EFEMP1基因的表達對MPM患者的總生存率（overall survive，OS）及無疾病進展生存率（disease free survive，DFS）均無顯著影響（LogrankP＞0.05）。結果如圖2。

2.4 MPM組織中EFEMP1基因與其他基因mRNA表達量的相關性

通過cBioportal工具對MPM組織中EFEMP1基因表達相關性進行可視化分析。選取在MPM組織中EFEMP1基因表達相關性最高的9個基因，分別為UDP-葡萄糖焦磷酸化酶2（UDP-glucosepyrophosphorylase2，UGP2）、轉 錄 因 子 4（transcription factor 4，TCF4）、活化的T細胞核因子 4（nuclear factor of activated T cells 4，NFATC4）、RAS 相 關 基 因 2（rasrelated 2，RRAS2）、膜聯蛋白 A3（annexin A3，ANXA3）、柔滑素（smoothelin，SMTN）、尿蛋白 1B（uroplakin 1B，UPK1B）、醇脫氫酶 6（alcohol dehydrogenase 6，ADH6）和DNA損傷識別和修復因子XPC復合體（XPC complex subunit，XPC）基因。其中，UGP2、RRAS2、ANXA3、UPK1B、ADH6、XPC與EFEMP1基因表達量呈顯著正相關（P＜0.05），TCF4、NFATC4、SMTN與EFEMP1基因表達量呈顯著負相關（P＜0.05）。結果見圖3。

3 討論

表1 EFEMP1基因mRNA表達量與MPM患者臨床病理特征的相關性

圖2 EFEMP1基因mRNA表達量與總生存率的關系

MPM是一種罕見的胸腔惡性腫瘤，起源于胸膜腔的間皮細胞[9]。MPM總體預后較差，上皮型MPM預后相對較好，肉瘤型預后最差，未經治療的MPM中位生存期為12個月，6個月、1年和5年的生存率分別為55%、33%和5%[10]。MPM是一種致死性極強的腫瘤，其惡性程度高，潛伏期長，早期臨床表現無特異性，多數患者被發現時已是晚期[11]。MPM在早發現、早診斷和早治療等環節的檢查技術薄弱，缺乏特異性診斷和預后的腫瘤生物學標記物。纖蛋白3可以單獨表現出與組織特異性表達有關的抑癌或致癌行為[12-13]。研究顯示，纖蛋白3在MPM患者中的表達水平普遍升高，且纖蛋白3不僅在腫瘤組織中過表達，在胸腔積液和血漿中也有較高水平的表達[14]。由此提出，纖蛋白3可能在MPM中起致癌作用。對MPM細胞系的體外研究及體內移植瘤研究進一步表明MPM細胞表達和分泌纖蛋白3，并且是患者血漿樣本中纖蛋白3的來源。在生理情況下，纖蛋白3以單體形式存在，在正常組織中低表達，而在內皮細胞和上皮細胞的基膜中高表達，可介導細胞與細胞、細胞與間質之間的信號傳導[15]。近年來許多實驗也證明，纖蛋白3可正向調控多種腫瘤細胞的生長及分化增殖，并參與腫瘤細胞抗凋亡作用[16-18]。關于纖蛋白3在各種類型腫瘤中的研究，特別是在MPM中的表達及意義也越來越受到人們的關注。

圖3 MPM組織中EFEMP1基因與其他基因mRNA表達量的相關性

在本研究中，我們首先通過數據挖掘分析了EFEMP1基因mRNA的表達與MPM發生之間的相關性，發現EFEMP1基因在正常肺組織或正常胸膜組織中均低表達，在MPM組織中顯著高表達，并且EFEMP1基因mRNA的表達量與腫瘤的T分期、病理類型及組織學診斷類型有顯著相關性。莫世賢采用隨機效應模型，發現試驗組（MPM組）患者血液及胸腔積液的纖蛋白3水平高于對照組（非MPM組）[19]。因此，纖蛋白3對于診斷MPM具有較高程度的敏感性和特異性，可作為MPM臨床早期診斷的輔助方法。為了比較纖蛋白3與間皮素作為MPM相關生物標志物的價值，Creaney等采用ELISA測定了153例胸腔積液患者血漿和胸水中的纖蛋白3及間皮素水平，發現間皮素在診斷MPM方面優于纖蛋白3，而在判斷患者預后方面則是纖蛋白3更優[20]。然而，本研究的預后生存分析結果顯示，EFEMP1基因mRNA表達量與MPM患者的總體生存率和無疾病進展生存率之間并無顯著關聯?；虮磉_相關性分析表明，UGP2、RRAS2、ANXA3、UPK1B、ADH6、XPC與EFEMP1基因表達量呈顯著正相關，TCF4、NFATC4、SMTN與EFEMP1基因表達量呈顯著負相關，提示EFEMP1基因在MPM發生過程中可能需要與其他基因相互協同才能發揮作用。

MPM發病機制復雜，臨床病例較為少見。本研究使用TCGA中MPM數據集的病例數據及預后資料，臨床數據樣本量更大，所得結果的可信度較高。綜上研究表明，EFEMP1基因mRNA在MPM組織中過表達，它可以作為該疾病診斷的潛在生物標志物，這可為MPM的臨床診療提供一定的參考。