大鼠Klotho蛋白水平隨血壓升高而降低

王彥琛，楊偉，張瑋，羅丹，蘇顯明

1.咸陽市中心醫院 老年病科，陜西 咸陽 712000；

2.西安交通大學第一附屬醫院 老年心血管內科，陜西 西安 710061

高血壓是一種發病率高、可導致全身組織器官產生多種嚴重并發癥的慢性疾病，不僅給患者自身帶來病痛，而且給患者及家庭也帶來嚴重的心理及經濟負擔，已成為全球健康問題[1-2]。目前高血壓的發病機制尚未完全闡述清楚。研究發現，Klotho（kl）蛋白能夠修復受損內皮細胞，通過內皮釋放含一氧化氮（NO）的體液途徑來保護心血管系統免受損傷，推測與高血壓發生有一定的關系[3-4]。我們在建立高血壓大鼠模型后，檢測了血漿中kl蛋白和NO水平隨血壓水平變化的規律，以明確kl蛋白與高血壓發生發展的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

7周齡雄性SD大鼠（體質量200±10 g）由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，隨機分為高血壓組和對照組，每組24只。造模組給予N'-硝基-L-精氨酸98 mg/d連續灌胃[5]，對照組給予等體積生理鹽水灌胃1/d，共28 d。

大鼠腎小管上皮細胞、大鼠腎小管上皮細胞完全培養基購于普諾賽公司；N'-硝基-L-精氨酸購于凡科維公司；PBS購于上海雙螺旋生物科技有限公司；kl蛋白、血栓素（TXA2）、內皮素（ET）酶聯免疫法、NO一步法、丙二醛（MDA）TAB法、超氧化物歧化酶（SOD）WST-1法試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；倒置相差顯微鏡為OLYMPUS公司產品；酶標儀購于上海賽默飛世爾科技有限公司；BP-300A全自動大小鼠無創血壓測量系統購于成都秦盟軟件有限公司。

1.2 樣本采集與處理

實驗開始前先分別用 0、100、200 μmol/L 的N'-硝基-L-精氨酸干預大鼠腎小管上皮細胞，24 h后Real-time PCR檢測kl基因的表達變化。

分別于造模成功停藥后第 7、14、21、28 d稱重，測安靜狀態下大鼠尾動脈血壓3次，取平均值，每組抽取6只體質量相近的大鼠，用10%水合氯醛按0.35 mL/100 g麻醉，取腹主動脈血EDTA抗凝，離心血漿，-20℃保存，用于檢測kl蛋白、TXA2、ET、MDA、NO含量及SOD活力。采血后立即處死大鼠，快速取出胸主動脈，生理鹽水沖洗，10%甲醛固定，常規石蠟切片，分別用于HE染色、免疫組化CD31標記。

1.3 PCR檢測kl基因的表達

將腎小管上皮細胞傳代、計數、凍存，細胞生長至密度80%左右進行加藥處理，各組加入N'-硝基-L-精氨酸的濃度為 0、100、200 μmol/L，培養24 h后提供細胞進行熒光定量PCR檢測。檢測所需的kl及β-actin引物從萬科生物科技公司訂購，引物序列見表1。

1.4 血漿kl蛋白、TXA2、ET含量測定

采用ELISA試劑盒，酶標儀測定D450nm值，根據標準品吸光度及濃度繪制標準曲線，根據標準曲線計算樣本濃度。

1.5 血漿NO、MDA含量及SOD活力測定

分別采用試劑盒測定血漿NO、MDA含量及SOD活力。

1.6 統計學分析

采用SPSS19.0軟件進行統計學分析，實驗數據以x±s表示，采用t檢驗比較2組大鼠實驗初始的收縮壓。采用析因設計方差分析干預后2組大鼠收縮壓的變化。采用兩因素多水平析因設計對2組大鼠的kl蛋白濃度，NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力進行分析整理。

2 結果

2.1 動物模型的建立

實驗開始前用不同濃度的N'-硝基-L-精氨酸干預大鼠腎小管上皮細胞，Real-time PCR檢測，結果顯示N'-硝基-L-精氨酸影響kl基因的表達，因此在干預藥物停藥1周后測定實驗數據，避免造模藥物影響實驗數據的準確性。PCR產物擴增的特異性經擴增曲線及熔解曲線確定（圖1），用2-△△Ct法計算mRNA表達水平（圖2）。

表1 引物及序列

表2 2組大鼠用藥前收縮壓比較（n=48）

圖1 kl基因（A）和β-actin（C）的熔解曲線及kl基因（B）和β-actin（D）的擴增曲線

2.2 血壓水平結果

實驗初始分別檢測48只大鼠的收縮壓，2組大鼠的收縮壓差異無統計學意義（t=0.820，P=0.417）（表2）。經藥物干預后，分別在停藥后的第7、14、21、28 d測量2組大鼠的收縮壓，結果見表3。采用析因設計方差分析2組大鼠的收縮壓（表4）。在α=0.05水準上，校正模型檢驗F=171.841，P=0.000，模型具有統計學意義。在是否用藥與時間的交互作用統計分析結果中，F=19.706，P=0.00，需要進一步闡釋。在分析是否用藥的單獨效應結果中，F=1126.251，P=0.000，差異有統計學意義，即高血壓組的收縮壓與對照組的收縮壓的影響有顯著性差異，且高血壓組的收縮壓明顯高于對照組。進一步分析7、12、21、28 d的收縮壓變化情況，結果表明差異有統計學意義（F=21.064，P=0.000），而且隨著時間的推移，血壓不斷升高。

2.3 各組 kl蛋白、NO、TXA2、ET、MDA 含量及SOD活性的變化

采用N'-硝基-L-精氨酸誘導大鼠高血壓實驗模型。為評估實驗模型的有效性，實驗中引入TXA2、ET、MDA含量及SOD活力檢測。

對2組大鼠的kl蛋白、NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力進行分析、整理。通過血壓、干預后持續時間2個因素進行多水平析因設計，血壓分對照組、高血壓組2個水平，干預后持續時間分為7、14、21、28 d共4個水平，采用兩因素多水平析因設計，共8種組合，每組6例，共48例。實驗設計，kl蛋白、NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力情況分別見表5、圖3、圖4。

圖2 不同濃度N'-硝基-L-精氨酸干預大鼠腎小管上皮細胞kl表達情況

表3 2組大鼠用藥后收縮壓變化情況

表4 2組大鼠用藥后收縮壓變化的方差分析結果

圖3 2組大鼠ET、TXA2、MDA含量及SOD活力隨時間變化趨勢

表5 2組大鼠用藥后kl蛋白、NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力情況描述

從析因設計方差分析結果（表6）可以看到，在α=0.05水準上，kl蛋白、NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力的P值均＜0.05，說明模型均有統計學意義。血壓、時間之間的交互作用對kl蛋白、NO、ET、MDA含量及SOD活力的影響有統計學意義（均為P＜0.05），但對TXA2含量的影響無統計學意義（P＞0.05）。就血壓的單獨效應結果來看，單獨血壓對NO、ET、TXA2、MDA含量的影響有統計學意義（均為P＜0.05），對kl蛋白濃度、SOD 活力的影響無統計學意義（P＞0.05）。就時間的單獨效應結果來看，單獨時間對NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力的影響有統計學意義（均為P＜0.05），對kl蛋白濃度的影響無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 2組大鼠kl蛋白、NO隨時間變化趨勢

表6 2組大鼠用藥后kl蛋白、NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力析因設計方差分析結果

2.4 血壓變化與主動脈壁HE染色及CD31標記

HE染色結果顯示，對照組大鼠主動脈管壁隨時間變化，細胞核的大小、排列、管壁厚度未見明顯的病理改變；高血壓組大鼠隨著高血壓的發生，主動脈壁彈力纖維增生、排列紊亂，細胞核逐漸增大變形，中膜逐漸增厚（圖5）。

CD31標記顯示，對照組大鼠主動脈內皮細胞隨時間無明顯變化，邊緣連續、光整，各時期無顯著差別；模型組大鼠隨著高血壓的發生，內皮細胞受損，逐漸減少、脫落，部分完全缺失（圖6）。

3 討論

kl基因是Kuro等在1997年研究自發型高血壓時發現的與衰老有關的新基因[6]。研究發現，人和大鼠的kl基因有83%的同源性，主要在腎臟和腦表達。該基因敲除鼠出生后4周齡左右出現動脈硬化和異位鈣化，并隨增齡而加重[7]。將kl雜合子鼠和野生型鼠同時放在高壓環境下20 h后，雜合子鼠主動脈對乙酞膽堿松弛反應的有效劑量增高，小動脈對乙酞膽堿所引起的舒血管反應明顯減弱[3]，推斷kl蛋白能夠通過內皮釋放NO產物的體液途徑來保護心血管系統免受損傷。另有研究發現，kl蛋白可以減少過氧化氫所誘導的內皮細胞凋亡和衰老，并增強血管內皮細胞活性，降低 caspase-3、caspase-9 的活性[8]。缺乏 kl基因的小鼠，其骨髓、外周血中的內皮祖細胞（EPC）數量明顯下降，而EPC的生理作用是當血管受損時可以遷移、黏附到受損部位，通過增殖、分化作用為內皮細胞修復受損的血管，因此考慮kl可能與EPC相互作用，參與血管損傷修復[9]。本課題組既往臨床研究[10]了高血壓組與非高血壓組人群的kl蛋白與NO水平，發現高血壓患者血清中kl蛋白隨NO的增加而增加，kl蛋白與NO之間存在正相關，推斷kl蛋白的降低可引起NO減少，而NO減少使NO/NOS系統功能低下，造成血管收縮、舒張不平衡，促進動脈粥樣硬化的發生，最終導致高血壓的發生。

本實驗通過觀察非高血壓和高血壓大鼠生長發育及疾病發生發展過程中kl蛋白、NO的變化，進一步推測kl與NO之間的關系。通過上述數據的分析（表6），我們可以觀察到，僅血壓的單獨效應或者僅時間的單獨效應對kl蛋白的影響無明顯統計學意義，但血壓及時間交互作用后對kl蛋白的影響有統計學意義，說明kl的表達變化在高血壓發生發展進程中有時間累積效應，而非受短期血壓波動影響。我們發現隨著時間的延長、血壓的逐漸升高，kl蛋白發生了規律性變化：kl總體呈逐漸下降趨勢，但7～21 d高血壓組大鼠kl蛋白水平明顯高于對照組大鼠，21～28 d高血壓大鼠kl蛋白水平低于對照組。高血壓早期的病理生理變化是血管內皮損傷，而既往研究顯示，kl蛋白在一定條件下可以與機體內的多種血管活性物質發生作用，使血管的舒張作用加強，抑制動脈硬化的發生，最終達到對血管內皮細胞的保護作用[11-12]。且該蛋白可以與VEGFR-2受體發生作用，保持內皮細胞的完整性[7]。因此推測在高血壓初期，kl蛋白可能因為血壓升高、反饋表達增加，發揮其保護血管內皮、降低血壓的作用；而隨著血壓的穩定高水平，kl蛋白濃度顯著降低，低于對照組水平，說明長期高血壓可影響kl蛋白合成。因kl蛋白主要表達于腎臟遠曲小管及脈絡膜[13]，遠曲小管是離子轉運和分泌的重要場所，其功能受醛固酮和抗利尿激素的調節，有研究發現RASS系統中血管緊張素Ⅱ可抑制kl mRNA表達，故在RASS系統對腎臟kl表達調節中，Ang應發揮著主導作用，因此高血壓發生時，RASS系統激活，抑制kl基因的表達，kl蛋白最終減低，支持我們所觀察到的kl蛋白表達水平變化趨勢。

從上述數據可以看出，NO在血壓、時間及其2組之間交互影響時差異均有統計學意義。我們發現2組大鼠的NO也存在顯著差異：NO水平隨血壓升高及時間延長總體趨勢逐漸降低，與血壓呈負相關；但7～14 d高血壓組大鼠NO水平明顯高于對照組大鼠，14～28 d高血壓組大鼠NO水平低于對照組（圖4）。已知內皮細胞是血管中NO的主要來源，內皮細胞通過合成和分泌的NO來參與調節血管張力、血壓和血管重塑等生理作用。高血壓早期內皮細胞受損，NO產生減少。但是我們觀察到在高血壓發生的7～14 d NO水平高于對照組，與kl蛋白的波動趨勢一致，結合上述kl蛋白升高的原因，我們考慮kl蛋白通過影響內皮細胞來影響體內NO的含量，共同調節血壓水平。

另有研究表示[14]，kl基因缺陷的小鼠在出生4周后即可出現動脈硬化，并隨增齡而加重，表現為主動脈嚴重鈣化，肌性中動脈中層鈣化、內膜增厚，腎臟小動脈嚴重鈣化等，這些血管變化與人類動脈硬化非常相似。把外源性正常kl cDNA轉導給kl基因缺陷小鼠后，其動脈硬化程度可顯著改善。本實驗的病理切片也發現，隨著高血壓的發生，出現了血管管壁彈力纖維增厚、排列紊亂，彈力纖維板層結構破壞；免疫組化CD31標記明確顯示內皮細胞不連續，逐漸變薄、缺失等內皮損傷改變，且在28 d時內皮缺失，這與我們觀察到的21～28 d時kl蛋白及NO顯著降低一致。

以上研究結果說明，在高血壓發生發展中，RASS系統激活，kl基因表達減低，伴隨kl蛋白減少，血管內皮受損、動脈硬化加重，NO進一步產生減少，血管收縮舒張功能失調，氧化應激加強，最終導致血壓進一步升高。提示kl蛋白可能通過內皮細胞調節NO的途徑參與血壓調節過程，參與高血壓的發生發展。