GP73參與肝癌索拉菲尼獲得性耐藥的初步研究

楊歡，彭雨蒙，李輝龍，韋猛，陳智煒，唐置鴻，孟維達，韋滔，魏從文，鐘輝，吳飛翔，3，4

1.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院 肝膽外科，廣西 南寧 5300021；2.軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100850；3.廣西肝癌診療工程技術研究中心，廣西 南寧 530021；4.區域性高發腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室，廣西 南寧 530021

原發性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的惡性腫瘤之一，每年新發病例和死亡病例均超過80萬例[1-2]。目前，中晚期肝癌患者以局部治療、系統治療等為主[3]。目前各種常見治療手段都有局限性，所以現在肝癌治療領域的共識是多學科協作和多種治療方法聯用的綜合治療[4]。綜合治療方法包括介入治療、消融治療、靶向治療、免疫治療和放化療等，由于分子靶向治療的選擇性、靈敏性和效率都很高，靶向治療以成為傳統肝癌治療手段之外極其重要的治療方法[5]。作為第一個被美國FDA批準用于治療肝癌的分子靶向治療藥物，索拉菲尼是肝癌系統性治療中惟一能夠改善患者存活率、顯著延長晚期患者總體生存時間的化療藥物。

索拉菲尼是一種新型多靶點抗腫瘤藥物，通過與細胞內ATP結合位點上的三磷酸腺苷競爭性結合，阻斷酪氨酸激酶和絲/蘇氨酸激酶的活性。大量臨床研究表明，絕大部分HCC患者通過一段時間的索拉菲尼藥物治療后，表現出明顯的藥物耐受特征，導致索拉菲尼對HCC的療效欠佳。多種機制與索拉菲尼的獲得性耐藥相關，有報道顯示腫瘤細胞SIRT1、EGFR或其配體等分子的過表達，PI3K/Akt、JAK/STAT3信號通路的異常激活，以及Ras/Raf/MEK/ERK通路的活性下調均降低HCC對索拉菲尼的敏感性[6-7]。

高爾基蛋白73（Golgi protein 73，GP73）又名GOLM1（Golgimembraneprotein1）或 GOLPH2（Golgi phosphorprotein 2），是2000年發現的一種高爾基膜蛋白，在正常肝臟的膽管上皮細胞中穩定表達[8]。70%以上的肝癌病人，GP73蛋白在血清及肝組織中的表達水平均顯著上調。最近的研究已證實GP73在肝癌發生發展和轉移中的重要作用，張宏冰等研究發現mTORC1能夠通過調節GP73促進肝癌的發生發展[9]。我們前期研究發現高表達的GP73抑制了由饑餓誘導的細胞自噬的激活，而GP73敲除細胞的自噬水平明顯升高。自噬在肝癌索拉菲尼的原發性耐藥中具有雙向作用。mTOR抑制劑雷帕霉素（rapamycin）并不能完全恢復耐藥細胞株對索拉菲尼的敏感性。這就提示我們，在索拉菲尼獲得性耐藥的HCC細胞中還有別的機制參與自噬的負調控。因此，研究GP73與索拉菲尼獲得性耐藥的關系對原發性肝癌的分子靶向治療具有重要意義。

在本研究中，我們探討了GP73在肝癌索拉菲尼耐藥細胞株中的表達情況，以及GP73對索拉菲尼耐藥性的影響，為GP73參與肝癌索拉菲尼獲得性耐藥的分子機制研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

肝癌細胞HepG2（本實驗室保存）；DMEM高糖培養基、胎牛血清（Gibco公司）；索拉菲尼（Sigma-Aldrih公司）；轉染試劑VigoFect（Qbiogene公司）；MTT檢測試劑盒（碧云天生物技術公司）；Flag-GP73、Flag-Vector（本實驗室構建）；si-GP73、si-scramble（吉瑪基因公司）；anti-GP73抗體、anti-Tubulin抗體（Abcam公司）。

1.2 細胞培養與轉染

HepG2細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基常規培養，構建耐藥細胞株時，在培養基中加入不同濃度的索拉菲尼。細胞轉染前1 h更換一半新鮮的DMEM培養基，按說明書要求配制小干擾RNA（siRNA）和轉染試劑混合液，滴加入細胞，常規培養，4～6 h后補充另一半培養基。

1.3 MTT法檢測細胞存活率

細胞接種于96孔細胞培養板，每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續培養4 h，酶聯免疫檢測儀測定各孔的D490nm值，計算細胞存活率。

1.4 蛋白免疫印跡實驗

收集細胞，1×PBS沖洗3次，3000 r/min離心3 min后棄上清。加入適量1×PBS重懸細胞，加入等量4×SDS緩沖液［10%甘油，2%十二烷基苯磺酸鈉，50 mmol/L Tris-HCl（pH6.8），2.5% β巰基乙醇，0.1%溴酚藍］，沸水浴15 min，12 000 r/min低溫離心10 min，取上清進行SDS-PAGE，半干轉到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶液室溫封閉1 h，一抗和二抗分別室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，將Perkin Elmer的ECL發光液均勻涂在PVDF膜上，暗室顯影。

1.5 數據分析處理

采用Graphpad prism 8.0進行統計學分析；計量資料采用x±s表示，組間比較采用雙因素方差分析；P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HepG2細胞索拉菲尼耐藥株的構建

在HepG2細胞培養基中加入索拉菲尼，使其終濃度為0.5 μmol/L，連續作用1周；換成新鮮培養基，鏡下觀察細胞正常生長后，增加0.25 μmol/L溶液繼續培養1周。如此反復換液、傳代，逐步提高索拉菲尼濃度（0.5～5 μmol/L）間歇誘導，最終獲得HepG2細胞的索拉菲尼耐藥株（HepG2-SR）。為了驗證構建的索拉菲尼耐藥細胞株對索拉菲尼的敏感性降低，在野生型HepG2細胞及索拉菲尼獲得性耐藥細胞株中加入不同濃度的索拉菲尼，MTT法檢測細胞的存活率。結果顯示，培養基中索拉菲尼濃度越高，細胞存活率越低；索拉菲尼耐藥細胞株對索拉菲尼的敏感性比野生型細胞大幅降低（P＜0.05）（圖1）。HepG2索拉菲尼耐藥細胞株建立成功。

2.2 GP73在肝癌索拉菲尼耐藥細胞株中的表達明顯升高

收集野生型HepG2細胞和HepG2索拉菲尼耐藥株細胞，分別加入等量的PBS和4×SDS緩沖液重懸，沸水浴15 min使細胞充分裂解。12 000 r/min低溫離心10 min，取等量上清進行SDSPAGE。半干轉到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶液室溫封閉 1 h，anti-GP73抗體（1∶1000 TBST溶解）、anti-Tubulin抗體（1∶5000 TBST溶解）室溫搖床孵育1 h，用5%脫脂奶粉以1∶2000的比例稀釋羊抗鼠HRP-conjugated二抗，室溫搖床孵育1 h，TBST洗3次，以1∶1的比例配制ECL發光液顯影。結果顯示，GP73在肝癌索拉菲尼耐藥細胞株中的表達比野生型細胞株高（圖2）。

2.3 過表達GP73的HepG2細胞對索拉菲尼敏感性降低

GP73在肝癌索拉菲尼耐藥細胞株中高表達，接下來將GP73在野生型HepG2細胞中高表達，研究GP73在肝癌細胞中對索拉菲尼敏感性的影響。在野生型HepG2細胞中轉染Flag-GP73，對照組轉染等量Flag-Vector，24 h后加入不同濃度的索拉菲尼（0、5、10、15、20 μmol/L）處理細胞，48 h后收取細胞，MTT法檢測細胞存活。結果表明，隨著索拉菲尼的濃度升高，細胞存活率明顯越低；而過表達GP73的HepG2細胞（Flag-GP73）對索拉菲尼的敏感性較對照組（Flag-Vector）降低（P＜0.05）（圖 3）。

2.4 耐藥細胞株敲低GP73能夠升高索拉菲尼的敏感性

GP73過表達后細胞對索拉菲尼的敏感性降低，接下來探討在肝癌索拉菲尼耐藥細胞株中敲低GP73后對索拉菲尼敏感性的影響。在已構建的索拉菲尼耐藥細胞株中轉染si-GP73敲低細胞中的GP73水平，對照組轉染等量的si-scramble。24 h后加入不同濃度的索拉菲尼（0、5、10、15、20 μmol/L）處理細胞，48 h后收取細胞，MTT法檢測細胞存活。結果表明，隨著索拉菲尼的濃度升高，細胞存活率明顯越低；而在索拉菲尼耐藥細胞中敲低GP73后，耐藥細胞株（si-GP73）對索拉菲尼的敏感性高于對照組（si-scramble）（P＜0.05）（圖4），表明耐藥細胞株敲低GP73能夠升高索拉菲尼的敏感性。

3 討論

圖1 索拉菲尼耐藥細胞株對索拉非尼的敏感性降低

圖2 GP73在肝癌索拉菲尼耐藥細胞株中高表達

原發性肝細胞癌作為發病率和病死率極高的癌癥之一，一直都是科研人員及臨床工作者努力攻克的難題。肝癌具有生長速度快、惡性程度高、易復發轉移及藥物耐受等特點，因此肝癌患者的預后較差[10]。索拉菲尼作為多靶點的分子藥物，在肝癌治療中能夠改善患者存活率，但其療效仍然有限，耐藥性的產生可能是導致其化療失敗的主要原因[11]。因此，研究肝細胞癌的耐藥機制，對于提高其化療療效，指導臨床用藥有著重要的價值。

GP73不僅可以作為肝癌的腫瘤標志物，也參與肝癌的發生發展過程[12]。我們研究發現，在索拉菲尼獲得性耐藥的肝癌細胞株中，位于高爾基體的糖蛋白GP73的表達水平顯著升高。此外，GP73過表達細胞對索拉菲尼的敏感性降低，GP73敲低恢復了耐藥細胞對索拉菲尼的敏感性。因此，GP73很可能參與到原發性肝癌索拉菲尼耐藥的機制當中。

圖3 GP73過表達細胞對索拉菲尼的敏感性降低

圖4 敲低GP73能升高索拉菲尼耐藥細胞株對索拉菲尼的敏感性

此前有研究發現自噬與腫瘤的發生密切相關[13]。Shimizu等發現，索拉菲尼可以激活HCC細胞的自噬，誘導自噬小體的形成，增強自噬的活性；而將自噬抑制劑與索拉菲尼聯用后，細胞凋亡增多，生存力下降，腫瘤生長受到明顯抑制。然而，Bareford等用索拉菲尼與自噬誘導劑培美曲塞聯合加入HCC細胞，發現培美曲塞與索拉菲尼可起協同作用[14]。可見，自噬在肝癌索拉菲尼的原發性耐藥中具有雙向作用。早前我們實驗室發現高表達的GP73抑制了由饑餓誘導的細胞自噬的激活，而GP73敲除細胞的自噬水平明顯升高。因而，GP73很可能通過負調控自噬，進而影響肝癌索拉菲尼獲得性耐藥。

綜上所述，我們發現GP73在肝癌索拉菲尼獲得性耐藥的過程中有重要作用，為深入研究索拉菲尼耐藥的分子機制奠定了實驗基礎。