CpG ODN B對雞新城疫重組桿狀病毒疫苗的免疫增強效應

王長麗，黃禎雄，王勝秋，呂進，賓曉蕓，楊睿睿，唐華英

右江民族醫學院，廣西 百色 533000

新城疫（Newcastle disease，ND）是由副粘病毒科、腮腺炎病毒屬的新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的禽類致死性傳染病，死亡率高、傳播速度快，感染后主要癥狀包括呼吸窘迫、腹瀉、黏膜出血、循環障礙和中樞神經系統損傷，甚至突發死亡[1-2]，對我國養雞業造成巨大的經濟損失[3]。目前，傳統NDV疫苗免疫最為常用，雖相對制造成本低廉，但存在保護率低、免疫周期短、接種次數多、劑量大等缺點[4]。NDV疫苗研究進展較快，從傳統滅活疫苗到亞單位疫苗、DNA疫苗、重組疫苗。重組桿狀載體疫苗相對免疫周期長、保護效價高，是目前預防ND普遍采用的疫苗手段。重組疫苗的臨床應用研究較少，通過添加佐劑增強免疫效果是一種主要的預防途徑。Gaston[5]首次提出免疫佐劑是一種用于提高疫苗中抗原免疫原性的輔助物質，能夠增強疫苗免疫原性和保護性。近年來，免疫刺激的DNA序列CpG ODN備受關注。CpG ODN（oligodeoxynucleotides containing CpG motifs）是含CpG基序的人工合成的寡聚脫氧核苷酸，常作為活疫苗佐劑，可以激活非特異免疫系統的細胞，進而刺激和調節獲得性免疫應答[6-7]，廣泛應用于禽類多種疫苗研究。根據結構和免疫活力的不同，可將CpG ODN分為A、B、C和P型[8]。其中，B型的作用效果已在臨床實驗中得到驗證[9-10]，能刺激B細胞增殖、NK細胞活化或分泌細胞因子分化。P型CpG ODN是一類新型佐劑，含有2個回文序列，它們刺激細胞產生IFN-α的水平較C型CpG ODN高，具有廣闊的應用前景[11]。近年來，重組疫苗在Th1或Th2型免疫應答方面具有局限性黏膜屏障是阻礙疫苗研究的的關鍵因素，尤其是B、P型CpG ODN。有關聯合重組疫苗使用的免疫效果研究較少，其是否具有增強重組疫苗免疫效果的機制尚不明晰。本研究以前期遺傳修飾改造的桿狀病毒為載體，將NDV關鍵保護性抗原基因F轉移至基因組中構建雞新城疫重組桿狀病毒疫苗BV-BXY-F，以人工合成型CpG ODN B、CpG ODN P為免疫增強劑，以鼻腔免疫方式進行雞體免疫，通過免疫水平檢測免疫過程中2種類型CpG ODN對增強雞新城疫重組桿狀病毒疫苗的免疫增強效應。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF雞、9～11日齡發育良好的雞胚購自廣州獸藥研究所；BV-BXY-F P3代雞新城疫重組桿狀載體病毒疫苗由右江民族醫學院科學實驗中心自行制備；雞胚成纖維細胞由實驗中心凍存；NDV F48E9原始毒株由本實驗中心保存；DMEM培養液、新生牛血清購自Hyclone公司。

CpG ODN B（根據Ren等[12]的研究參考CpG ODN 1826序列，5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'）、CpG ODN P（根據 Yang等[13]的研究參考CpG ODN 21798序列，5'-TCGTCGACGATCGGC GCGCGCCG-3'）、non CpG ODN B（5'-TGGATCA GCTTGGTCAGCTT-3'）、non CpG ODN P（5'-TG CTGCAGCATGCCGCGCGCGGC-3'）均用于雞體免疫試驗。

1.2 雞胚成纖維細胞的制備

選取9～11日齡發育良好的SPF胚，用滅菌鑷子敲開室部位，無菌取出雞胚，放入滅菌平皿中，去掉頭、尾、內臟和四肢，保留軀干部分，將肌肉組織用PBS沖洗2～3次，剪成細小泥狀放入10 mL離心管中，并向離心管內加入3 mL 0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化20 min，期間10 min輕搖1次，用3 mL、10%DMEM終止消化，采用6層紗布過濾細胞，濾液經800 r/min離心5 min，棄上清；重復1次上述操作；計數，用DMEM培養液將細胞沉淀重新懸浮至1.0×106/mL，分裝至培養瓶（5 mL/瓶），于37℃、5% CO2培養箱中培養。

1.3 TCID50的測定及免疫-攻毒試驗

測定半數組織培養感染劑量（TCID50）。參照1.2制備雞胚成纖維細胞（1.0×106/mL），并接種于96孔板（100 μL/孔），37℃、5% CO2培養箱中培養24～36 h至長滿單層細胞；用PBS將NDV F48E9病毒液進行梯度稀釋，將每個梯度的病毒稀釋液重復3個，以100 μL接種于鋪滿單層細胞的96孔板中，不接種病毒作為對照，F48E9病毒吸附CEF細胞1 h（37℃、5% CO2）后吸去病毒液，添加200 μL含10%血清的新鮮DMEM培養液培養，每隔12 h觀察一次至CEF細胞明顯病變；記錄每個稀釋度的病毒感染的CEF細胞出現細胞病變效應（CPE）的孔數，計算病毒TCID50。

免疫-攻毒試驗。選取14日齡SPF雞隨機分為6個試驗組（20只/組，雌雄各半）進行免疫滴鼻試驗，A～F組依次為BV-BXY-F+CpG ODN B組、BV-BXY-F+CpG ODN P組、BV-BXY-F+non CpG ODN B組、BV-BXY-F+non CpG ODN P組、BV-BXY-F單獨免疫組、PBS對照組。14、28 d進行首免和二次免疫，每只200 μL BV-BXY-F+2 μg CpG ODN混合后滴鼻免疫，采用NDV F48E9病毒株對各組雞只進行滴鼻攻毒（42日齡），攻毒劑量104EID50/只，攻毒后觀察各組雞體免疫指標變化，直至飼養至10周，統計臨床保護率。

1.4 中和抗體效價檢測

通過免疫雞血清中和抗體效價檢測試驗考察6組免疫雞血清抗體對NDV F48E9病毒的中和能力，進而評定加入CpG ODN后對雞體體液的免疫效果。所有免疫組于14、28、42、56和70日齡隨機翅靜脈采血6只，每只取樣500～1000 μL，室溫靜置，離心分離血清于-20℃保藏；將制備好的雞胚成纖維細胞接種于96孔板，37℃、5% CO2培養24～36 h至細胞長滿單層；用PBS將DNV F48F9病毒株稀釋至100 TCID50備用；待測血清融化后56℃水浴30 min，用PBS稀釋血清樣品 70 μL/孔；取 70 μL 病毒稀釋液加至每個稀釋度血清樣品中，37℃、5% CO2中和反應1 h；吸去96孔板中的DMEM培養液，PBS洗滌2次，將20～30 μL病毒血清中和溶液加入CEF細胞中，每個中和溶液設置3個平行孔，同時設定純血清和100 TCID50的病毒液為對照組，吸附反應l h；吸去中和液，加DMEM完全培養液，37℃、5% CO2培養96 h，每隔12 h觀察、記錄細胞病變情況，按Reed-Muench法計算每組血清樣品的中和保護價（protective dose，PD50），計算每組血清 PD50的幾何平均數，即為該日齡雞血清的中和抗體幾何平均滴度（geometric mean titer，GMT）。用ELISA檢測試劑盒分別檢測IgG、IgA、sIgA（分泌型IgA）抗體，評價6組雞血清抗體NDV體液免疫和黏膜免疫水平。

1.5 淋巴細胞增殖試驗

利用刀豆蛋白A（ConA）或病毒的特異性抗原刺激，提取雞外周血T淋巴細胞，引起增殖效應，根據試驗組T淋巴細胞的免疫刺激指數（stimulation index，SI）評估不同刺激組的細胞免疫效果。每組選取3只雞在首免、二免后的1周（21日齡和35日齡），攻毒后1、2周（49日齡和56日齡）翅靜脈采血2 mL，分裝于10 mL EP管中，等體積稀釋混勻，將稀釋血液沿管壁緩慢加入雞淋巴細胞分離液上（稀釋血液與分離液柱高比為3∶2～2∶1），2000 r/min離心20 min，試管中的液體可以分為4層，用1 mL注射器緩慢吸取離心管中間的白色細胞層，將其放入新的10 mL EP管中，加入D-Hank's液重復洗滌2次，1500 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL RPMI1640重懸淋巴細胞（1.0×107/mL）；按照G3580試劑盒說明，加入各試驗組的淋巴細胞，每孔 50 μL（5.0×105/孔），共設NDV刺激孔（含50 μL NDV的細胞懸液）、ConA刺激孔（陽性對照，含5 μg/mL ConA的細胞懸液）及相應對照孔（含50 μL RPMI1640培養基）3組，重復 3個，37℃、5% CO2培養 48 h，每孔加入10 μL CellTiter 96 Aqueous One Solution 試劑，37℃恒溫孵育4 h，酶標儀檢測D490nm，取3個平行孔的平均值，計算刺激指數。SI=試驗組D490nm平均值/相應對照組D490nm平均值。

1.6 細胞因子檢測

不同試驗組分別在 14、28、42、56及 70日齡隨機翅靜脈采血6只，每只0.5～1 mL，離心分離血清，用細胞因子ELISA試劑盒測定雞血清中細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和CD4+T細胞、CD8+T細胞的濃度。

1.7 實驗數據的統計學分析

所有數據用Origin8.0和Excel軟件進行統計學分析，數據均以x±s表示，均數間的比較采用差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 免疫雞攻毒存活率和臨床癥狀

結果得到TCID50=10-4.5/100 μL，首免和二免后雞只表現正常，但攻毒2～7 d后均出現不同程度的發病，主要表現為精神低靡、食欲不振、呼吸困難、飲水增多、排便異常，發病后期部分雞只出現臥地不起、轉脖癥狀，甚至死亡。免疫雞攻毒結果顯示（圖1），BV-BXY-F+CpG ODN B聯合免疫組（A組）存活率為100%，較BV-BXY-F+CpG ODN P組（B組）、BV-BXY-F單獨免疫組（E組）分別提高了31.43%和46.73%。結果表明，免疫佐劑CpG ODN B不僅能夠增強BV-BXY-F疫苗對雞的保護率，且效率明顯優于其他組。

2.2 免疫雞外周血T淋巴細胞增殖情況

圖1 6組免疫雞只生存情況分析

圖2 雞體免疫后淋巴細胞增殖情況

如圖2所示，試驗組（A和B組）和對照組（E和F組）的T淋巴細胞受NDV和ConA刺激后均出現增殖反應，隨著天數的增加，各組雞的免疫刺激指數SI出現先升高后降低趨勢，49 d試驗組SI值達到最大分別為 4.52±0.07、4.26±0.09，與對照組（3.01±0.17、0.67±0.05）相比差異極顯著（P＜0.01），且A組免疫雞淋巴細胞的SI值與B組相比差異顯著（P＜0.05），說明添加CpG ODN B對雞體刺激可以產生較強的黏膜免疫應答反應，效果優于其他試驗組。

2.3 中和抗體、sIgA、IgG和IgA的測定

如圖3所示，A～E組免疫前（14日齡）中和抗體效價和sIgA含量均較低，但在首免和二免后中和抗體效價、sIgA水平均開始上升后下降，分別在42和56 d時達到最大，而PBS對照組抗體始終維持較低水平無明顯變化。42 d時，A、B組免疫雞血液中和抗體效價分別為1634.56±2.65和1237.52±2.21，與E組（863.08±3.24）相比差異極顯著（P＜0.01）；56 d時，A、B組免疫雞鼻腔中 sIgA抗體水平分別為435.06±2.01和401.19±3.50 ng/L，與 E組（382.60±2.69 ng/L）相比差異顯著（P＜0.05）。同時，A組免疫雞血清中和抗體效價和免疫雞鼻腔中sIgA抗體水平分別較B組提高了32.08%和8.44%，差異顯著（P＜0.05）。結果說明CpG ODN對重組疫苗BV-BXY-F起到了免疫協同作用，能刺激雞體產生體液免疫應答，添加CpG ODN B能夠對BV-BXY-F起到較強的免疫協同作用，刺激雞體產生較強的黏膜免疫應答，效果優于其他組，檢測結果與攻毒保護結果基本吻合。

如圖4所示，各試驗組首免后免疫雞血清中IgG和IgA抗體水平呈先升高后降低，56 d和42 d時各組IgG和IgA值達到最大，而PBS對照組免疫雞血清中IgG和IgA抗體水平始終較低。A組免疫雞血清中IgG和IgA抗體含量較E組分別提高了10.4%和21.3%，且差異顯著（P＜0.05），B組的IgG和IgA抗體水平則低于E組。與此同時，A組免疫雞血清中IgG和IgA抗體含量較B組分別提高了 13.56%和 23.71%（P＜0.05），表明添加 CpG ODN B可以協同重組疫苗，更好地刺激雞體產生更強的黏膜免疫應答和體液免疫應答反應。

2.4 細胞因子免疫指標分析

A組IFN-γ、IL-2、IL-4、CD4+T細胞和CD8+T細胞含量分別為 613.34±2.87（56 d）、798.66±3.47（42 d）、963.48±5.55（42 d）、132.46±0.37（56 d）、192.32±0.25（42 d），與 B 組相比差異顯著（P＜0.05），與E組相比差異極顯著（P＜0.01）。說明添加CpG ODN B對BV-BXY-F起到了免疫協同作用，能刺激機體產生細胞免疫應答，誘導雞體產生較強的黏膜免疫應答。

70 d時，A組細胞因子仍維持較高水平，IFN-γ、IL-2、IL-4、CD4+T細胞和CD8+T細胞含量分別為 126.89±1.59、162.24±3.54、155.26±2.93、46.29±0.22、46.64±0.80，與B組相比差異顯著（P＜0.05），與E組相比差異顯著（P＜0.05）。說明添加CpG ODN B，在免疫后期能協助重組疫苗刺激機體產生細胞免疫應答，誘導雞體黏膜免疫應答。綜上所述，添加CpG ODN B對雞新城疫重組桿狀病毒疫苗有增強效應。

圖3 雞體免疫組誘導NDV中和抗體效價和雞鼻腔中sIgA抗體水平

圖4 雞血清中IgG和IgA抗體水平

3 討論

新城疫是禽類致死性傳染病，對我國養禽業造成巨大的經濟損失。添加CpG ODN對增強雞新城疫重組桿狀病毒載體疫苗是臨床上有效的預防手段之一。CpG ODN可激活哺乳動物、禽類及魚類的免疫系統，通過天然免疫系統增強機體對外界病原的抵抗力[14]。在雞體內，TLR配體作為佐劑可以增強對病毒、細菌、寄生蟲感染的免疫防護，獲得了理想的結果[15]。B型CpG ODN 2007與H9N2禽流感病毒滅活疫苗聯合肌肉注射雞群，能夠更加有效地刺激產生中和抗體免疫應答，中和抗體水平顯著高于以角鯊烯基為佐劑的疫苗[16]；CpG ODN 2007與NDV滅活疫苗聯合鼻內給藥免疫雞群，提高了血清IgG和sIgA的表達水平，可以誘導T細胞的分化，保護雞群免受NDV強毒株的致死性攻擊[17]；CpG ODN 2007可以通過上皮樹突狀細胞的吸收，幫助H9N2禽流感病毒穿過鼻黏膜上皮細胞，這是最佳固有免疫應答的一個全新機制[6]。上述研究表明CpG ODN可以有效激活雞體的黏膜和全身免疫應答，為進一步發展滴鼻的禽類病毒疫苗提供了全新前景。隨著研究的深入，發現通過改變CpG ODN的序列和結構來改變其類型和性質，可以優化其免疫增強效果，但不同類型CpG ODN對于不同類型疫苗黏膜免疫效果的影響不同。

本研究以人工合成的2種類型的CpG ODN為免疫佐劑，與雞新城疫重組桿狀病毒載體疫苗BV-BXY-F混合后在雞體內進行滴鼻免疫及攻毒保護實驗。結果表明，CpG ODN B聯合免疫組的雞只保護率達100%，而CpG ODN P聯合免疫組的存活率為68.57%，表明不同類型CpG ODN的免疫協同能力確有不同。He[18]等在評價各類合成CpG ODN誘導火雞先天免疫應答能力時同樣發現，不同CpG基序和不同序列結構對于CpG ODN的免疫刺激活性有很大的影響。該團隊通過測量火雞外周血單個核細胞中的NO產量來評價CpG ODN誘導火雞先天免疫應答能力，結果發現能夠誘導NO大量產生的CpG ODN是人特異性CpG ODN M362，隨后是CpG ODN 2006（人）和CpG ODN 1826（小鼠）。可見，在眾多類型的CpG ODN中，CpG ODN 1826具有較強的免疫刺激作用，故本研究中合成的CpG ODN序列參照文獻中的CpG ODN 1826序列進行設計，結果表明CpG ODN B對雞新城疫桿狀病毒疫苗的免疫增強效果較好。另外，添加CpG ODN B聯合免疫組的中和抗體水平也明顯高于添加CpG ODN P組，此結果與Wang[19]等分別以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌和B類CpG ODN作為免疫佐劑與H5N1滅活油乳劑疫苗聯用進行雞體免疫結果類似。可見，添加CpG ODN B對雞新城疫重組桿狀病毒疫苗有較強的免疫協同作用。本研究中聯合免疫組BV-BXY-F+CpG ODN B的免疫雞血清IgG和IgA抗體水平較BV-BXYF+CpG ODN P組分別提高13.56%和23.71%。Gomis[20]等將CpG ODN注射至雞的感染部位時發現注射部位的IgG抗體水平明顯升高，表明CpG ODN可誘導雞體產生不同水平的黏膜免疫應答，進而刺激不同水平的體液免疫應答。細胞免疫應答水平方面，CpG ODN B聯合免疫組免疫雞血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的含量均明顯高于CpG ODN P聯合免疫組，此結果與Chrzastek[21]等一致，免疫雞外周血淋巴增殖試驗亦得到相似結果。表明不同類型的CpG ODN可誘導雞體產生不同水平的細胞免疫應答，其中CpG ODN B的免疫增強效果最為顯著。

此外，CpG ODN B聯合免疫組的sIgA水平遠高于CpG ODN P聯合免疫組，且差異顯著，此結果與Iho[7]等一致。可見，CpG ODN確實可作為黏膜佐劑進行機體免疫，協助各類疫苗提高其免疫效果，且CpG ODN B和CpG ODN P具有不同的免疫協同作用。從結果來看，當CpG ODN B刺激雞體黏膜組織時可產生較高水平的黏膜免疫應答，進而誘導雞體產生較高水平的全身系統性免疫應答，以全面提高疫苗的免疫保護效果，添加CpG ODN B對雞新城疫重組桿狀病毒疫苗的增強效果較好。