原發性干燥綜合征患者血清高密度脂蛋白水平及與炎癥的相關性分析

楊雪君，王森，潘婕，徐志曄

南京大學醫學院附屬鼓樓醫院 檢驗科，江蘇 南京 210008

原發性干燥綜合征（primary Sjogren's syndrome，pSS）是一種主要累及外分泌腺的慢性炎癥性自身免疫病[1]，多發于老年人群，女性多見，男女比例約為1∶9～1∶20。pSS的病因及發病機制有多種理論，可能與遺傳因素及免疫細胞功能異常相關，但具體的機制仍未完全明確[2-4]。pSS患者體內多種免疫細胞功能異常導致一些細胞因子如TNF-α、IL-6、IL-17等異常表達，這些細胞因子的異常表達及調節紊亂在干燥綜合征的發病和進展中具有重要作用[5]。高密度脂蛋白（highdensity lipoprotein，HDL）可以逆向轉運膽固醇，具有抗動脈粥樣硬化的作用，以往的研究多集中于HDL在動脈粥樣硬化進展中的效力，但近年來的研究表明HDL還具有重要的免疫調節及抗炎作用[6-9]。HDL在自身免疫性疾病特別是pSS中的表達水平及與炎癥的關系尚未見明確報道。在此，我們將回顧性分析HDL在pSS患者血清中的表達水平，并通過相關實驗研究其與炎癥的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2019年1～12月在我院風濕免疫科住院的350例pSS患者的臨床數據，其中男性28例，女性322例，平均年齡52.7歲，pSS的診斷符合2016年美國歐洲風濕病聯盟制定的分類診斷標準[10]。對照組為健康體檢者共350例，男性30例，女性320例，平均年齡51.6歲。患者組與健康對照組性別年齡間無統計學差異。另外收集30例干燥綜合征患者及30例年齡性別匹配的健康體檢者外周血血清，以檢測血清中的細胞因子水平及HDL水平。

1.2 材料

HDL及低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）（ProSpec公司）；脂多糖（LPS）（Sigma公司）；淋巴細胞分離液（國藥集團化學試劑有限公司）；RPIM1640細胞培養液（Thermo Fisher公司）；TNF-α、IL-6 ELISA檢測試劑盒（BD公司）；酶標儀（Bio-Rad公司）；臨床生化指標檢測全自動生化儀（Beckman公司）。

1.3 標本收集及檢測

30例pSS患者與30例健康對照分別空腹抽取5 mL靜脈血于含有分離膠和促凝劑的采血管，離心后取上清置于-80℃凍存，待標本收集完成后統一檢測HDL及細胞因子水平。

1.4 外周血單個核細胞（PBMC）的分離及培養

收集正常人新鮮外周血5 mL于EDTA抗凝管中，2000 r/min離心10 min，吸出上層血漿，剩余細胞加入等體積的PBS，混勻；準備2支15 mL的離心管，每管加入3 mL Ficoll，將混勻的細胞沿傾斜的管壁緩慢加入離心管中，配平后用水平轉子2300 r/min離心20 min，并設置離心機降速為最低；取出離心好的細胞，小心吸出血漿層與紅細胞層之間的細胞，加入5 mL PBS，1500 r/min離心5 min，去除上清后再次用PBS洗滌1次，棄上清，振蕩混勻細胞后加入2 mL RPMI1640培養液，重懸細胞并計數，調整細胞濃度為1×106/mL，鋪于24孔細胞培養板培養。

1.5 ELISA檢測細胞因子水平

配置含NaHCO3及Na2CO3的包被緩沖液，每個樣本用雙復空檢測，計算所需孔數，用包被緩沖液按1∶250的比例稀釋TNF-α及IL-6的包被抗體，按每孔100 μL加入新的包被板中，4℃孵育過夜；棄去包被液，每孔加入300 μL PBST洗滌3次，徹底去除孔中殘留液體；每孔加入200 μL含10%胎牛血清（FBS）的PBS液，室溫封閉1 h；按說明書要求稀釋標準品，并將樣本取出稀釋至1/2；每孔加入100 μL樣本、標準品或陰性對照；封板紙封閉板條，室溫孵育2 h；用樣本稀釋液按1∶250的比例稀釋二抗及辣根過氧化物酶（HRP）；棄去板孔中的樣本及標準品后用PBST洗滌板條5次，最后一次徹底去除板中殘留液體；每孔加入100 μL二抗及HRP混合液，封板并室溫孵育1 h；去除板中液體，再次用PBST洗滌5次；每孔加入100 μL顯色液，室溫避光孵育15 min，觀察顯色情況；每孔加入100 μL終止液終止反應；放入酶標儀，讀取D450nm值。

1.6 統計學分析

計量資料用x±s表示，患者組與對照組之間差異比較用Student'st檢驗。當P＜0.05時為差異有統計學意義，圖中用“*”標示，P＜0.01圖中用“**”標示。各指標的相關性研究采用Pearson相關性分析，統計學分析及做圖用GraphPad Prism 5軟件完成。

2 結果

2.1 pSS患者組與健康對照組血脂水平的比較

分析了pSS患者組及健康對照組之間血清中血脂指標的差異。如表1所示，pSS患者組HDL、LDL、ApoAI及膽固醇水平均顯著低于健康對照組（P＜0.0001），而載脂蛋白B（ApoB）及甘油三酯在2組間無明顯差異。

2.2 pSS患者血清HDL水平與炎癥免疫指標的相關性分析

分析了患者血清中HDL的水平與炎癥指標［紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）］及免疫指標（IgG、IgA、IgM、IgE）之間的相關性。如表2所示，HDL水平與 ESR（r=-0.38，P＜0.0001）及IgG（r=-0.35，P＜0.0001）之間有顯著的相關性，而LDL水平與各炎癥指標及免疫指標均無明顯的相關性（表3）。

表1 pSS患者與健康對照者血脂水平比較

表2 pSS患者血清HDL水平與炎癥免疫指標相關性分析

表3 pSS患者血清LDL水平與炎癥免疫指標相關性分析

2.3 pSS患者血清HDL水平與炎癥細胞因子間的相關性分析

為了進一步研究pSS患者血清HDL水平與炎癥間的相關性，收集了30例pSS患者及30健康對照者血清，檢測血清中細胞因子IL-6及TNF-α的水平。如圖1A、C，pSS患者組的IL-6及TNF-α水平顯著高于對照組。分析pSS患者血清HDL水平及與細胞因子的相關性發現，HDL水平與IL-6及TNF-α的水平呈顯著的負相關（圖1B、D）。

2.4 HDL抑制PBMC中炎性細胞因子的產生

以上研究表明pSS患者血清HDL含量降低，并且HDL含量與炎癥指標及炎性細胞因子呈負相關。為了進一步證明HDL的抗炎作用，用純化的HDL及LDL預處理正常人PBMC 24 h，用LPS刺激細胞24 h，收集細胞培養上清，檢測TNF-α及IL-6的水平，發現HDL能以劑量依賴方式抑制TNF-α及IL-6的產生，而LDL無抑制作用（圖2）。

3 討論

pSS是一種慢性炎癥性的自身免疫性疾病，主要侵犯淚腺、唾液腺等外分泌腺，全身其他臟器也可受累。pSS患者血清中可檢測到多種自身抗體，同時患者外周血及受累器官局部炎性細胞因子水平也顯著升高。HDL因具有逆向轉運膽固醇的作用，所以在心血管疾病中具有保護作用，以往的研究關注HDL在心血管疾病中的作用，近年研究發現HDL具有抗炎作用，但在具體的疾病中HDL是否具有抗炎作用仍鮮有報道。本項研究發現pSS患者血清中的HDL水平顯著低于健康對照，并且pSS患者的HDL水平與ESR、IgG呈顯著負相關，與患者血清中細胞因子TNF-α、IL-6也具有顯著的負相關。表明pSS患者血清中HDL降低，并且與pSS患者的炎癥水平相關。

圖1 pSS患者血清HDL水平與細胞因子間的相關性分析

圖2 HDL抑制PBMC中細胞因子的產生

本研究檢測了pSS患者組及正常對照組間各血脂指標的含量，其中pSS患者組HDL、LDL、ApoAI、膽固醇的含量都顯著低于健康對照組。ESR和CRP是常見的反映自身免疫病活動性及炎癥水平的指標，IgG在干燥綜合征患者中普遍升高并與活動性相關，本研究發現HDL與ESR及IgG具有顯著負相關，表明HDL可能與pSS患者的炎癥及活動性相關。ESR和CRP均是非特異性的炎癥指標，為了進一步探討HDL與炎癥的相關性，我們還檢測了常見的炎性細胞因子水平，發現pSS患者血清中TNF-α及IL-6水平顯著高于健康對照，并且HDL與TNF-α及IL-6呈顯著的負相關，進一步表明在pSS患者中，HDL可能起到對抗炎癥的作用。

HDL除具有抗氧化、逆向轉運膽固醇的作用外，還具有抑制炎癥的作用。Lee等的研究表明HDL可通過使小窩蛋白caveolin-1重新分布，從而抑制巨噬細胞向促炎性M1型巨噬細胞分化，進而抑制ERK1/2及STAT3的激活并抑制TNF-α、IL-6和MCP-1等炎性細胞因子的產生[11]。De Nardo等的研究表明HDL及ApoAI可以顯著抑制Toll樣受體（TLR）介導的細胞因子產生，進一步的機制研究表明HDL是通過上調轉錄因子ATF3的表達進而抑制TLR介導的信號通路[12]。另有研究表明重組HDL可在樹突狀細胞（DC）中抑制PHA 誘導的 IL-6、IL-1β、IFN-α等細胞因子及CCL-2、CCL-4等趨化因子的產生，HDL也可顯著抑制TLR-2及TLR-4介導的DC的成熟[13]。這些研究表明HDL可抑制多種免疫細胞的激活，對天然免疫及適應性免疫都具有調節作用。在自身免疫性疾病中，有研究檢測了血清HDL水平降低，并認為這和自身免疫性疾病患者易發心血管疾病相關[14-15]。但HDL含量與患者炎癥水平之間的關系尚未見明確報道。本項研究表明干燥綜合征患者血清中HDL含量降低，并與炎癥水平負相關，細胞學實驗證明重組HDL可抑制炎性細胞因子的產生，表明在干燥綜合征中HDL同樣發揮著對抗炎癥的作用。pSS患者體內HDL水平降低的機制目前并不明確，有研究認為自身免疫性疾病患者體內可能存在抗HDL及抗ApoAI的自身抗體，而這些因素導致的HDL含量降低影響并阻礙HDL抗炎作用的有效發揮，這可能進一步又引起了患者體內出現過度炎癥。

綜上所述，本研究表明pSS患者血清中HDL、LDL的表達顯著低于健康對照，HDL水平與ESR和IgG，以及炎性細胞因子TNF-α和IL-6呈顯著負相關，細胞實驗證明HDL可顯著抑制LPS誘導的TNF-α及IL-6產生，表明在pSS中HDL與炎癥水平相關，并可能發揮抗炎作用。本研究提示重組HDL或升高HDL藥物有望抑制pSS患者的炎癥狀態，緩解并改善pSS患者的癥狀。