長鏈非編碼RNA SNHG16的表達對肺癌細胞增殖和化療耐藥影響的作用機制

姜翠紅，趙志正，劉睿，修俊青，譚鑫，王佳

中國中醫科學院 廣安門醫院南區腫瘤科，北京 102618

肺癌是威脅人類健康的主要癌癥之一，患病率和死亡率較高，隨著城市環境污染、人們生活方式的改變，其患病率依然逐年上升[1-2]。肺癌患者被確診時往往已是晚期，并且其轉移迅速，患者預后很差[2]。目前治療肺癌主要有手術、化療、放療、靶向治療和免疫治療等方法[2-4]，其中手術、化療和放療為癌癥的傳統治療手段，化療由于會使腫瘤細胞產生耐藥性，治療效果不佳，亟待尋找抑制肺癌細胞化療耐藥的治療手段[5]。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200 nt不編碼蛋白的RNA。研究表明，lncRNA在腫瘤發生發展和轉移過程中發揮作用[5-6]。lncRNA SNHG16被稱為小核仁RNA宿主基因16，最早在神經母細胞瘤中發現，已被證明在結直腸癌、胃癌及膀胱癌中具有致癌作用，但在肺癌中還罕見研究報道[7-9]。在此，我們主要探討SNHG16的表達對肺癌細胞增殖和吉西他濱化療耐藥影響的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

肺癌患者組織及癌旁組織樣本來自中國中醫科學院廣安門醫院；肺癌細胞系HCC827、A549、NCI-H1395、NCI-H1975及肺上皮細胞系BEAS-2B購自中國科學院上海生科院細胞資源中心；胎牛血清、RPMI-1640培養基及DMEM培養基購自Gibco公司；F12K培養基購自Sigma公司；谷氨酰胺、丙酮酸鈉購自Invitrogen公司；sh-SNHG16-1、sh-SNHG16-2、miR-520a-3p-inhibitor及 miR-520a-3p mimic購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；RNA提取試劑盒及cDNA合成試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；SYBR GreenⅠ核酸染料購自ThermoFisher公司；SNHG16引物由北京博邁德基因技術有限公司合成；CCK-8細胞存活率檢測試劑盒購自日本東仁化學公司；雙螢光素酶報告基因試劑盒購自Promega公司；MRP1、MRP2、ABCG2轉運蛋白一抗購自Abcam公司。

1.2 cDNA合成和qRT-PCR實驗

提取細胞總RNA，Nanodrop檢測RNA濃度，合成cDNA，合成樣品于-20℃保存備用。采用熒光染料法進行實時熒光定量PCR實驗。SNHG16上游引物為5'-CAGAATGCCATGGTTTCCCC-3'，下游引物為5'-TGGCAAGAGACTTCCTGAGG-3'；GAPDH上游引物為5'-ACGGGAAGCTCACTGGC ATGG-3'，下游引物為5'-GGTCCACCACCCTGTT GCTGTA-3'；miR-520a-3p 上游引物為 5'-GCAG AAAGTGCTTCCCTTTG-3'，下游引物為5'-GGTC CAGTTTTTTTTTTTTTTTACAGT-3'；U6上游引物為5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，下 游 引物為5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。

1.3 細胞培養和細胞轉染

肺癌細胞系HCC827、A549、NCI-H1395、NCIH1975及肺上皮細胞系BEAS-2B分別采用RPMI-1640、F12K、RPMI-1640和DMEM培養基培養，HCC827、A549及BEAS-2B細胞完全培養基中胎牛血清∶培養基為體積比1∶9，NCI-H1395和NCIH1975細胞完全培養基中胎牛血清∶培養基∶谷氨酰胺∶丙酮酸鈉為體積比88∶10∶1∶1。細胞在5% CO2、37℃恒溫培養箱中培養。分為sh-NC組、sh-SNHG16-1組、sh-SNHG16-2組，采用LipofectAMINE 3000向已接種細胞的6孔板中轉染，48 h后進行后續實驗。

1.4 細胞增殖率檢測

96孔板中按5×103/孔接種細胞，待細胞覆蓋率達到50%左右，分別加入完全培養基稀釋的0、5、10、20 μmol/L 的吉西他濱溶液，與細胞孵育48 h；棄去培養液，加入不含血清培養基配制的10% CCK-8反應液，將培養板繼續置于37℃恒溫培養箱培養40 min，酶標儀檢測D450nm值。

1.5 雙螢光素酶報告基因實驗

構建載體，即含miR-520a-3p結合位點的WT-SNHG16及Mut-SNHG16插入pmir-GO，采用LipofectAMINE 3000將 miR-NC、miR-520a-3p mimics共轉染肺癌細胞，48 h后分別檢測螢火蟲螢光素酶及海腎螢光素酶活性，結果表示為相對螢光素酶活性（螢火蟲螢光素酶活性/海腎螢光素酶活性。

1.6 蛋白質印跡實驗

用細胞裂解液于冰上裂解細胞，4℃、12 000 r/min離心10 min分離細胞碎片和上清液，Bradford法測定總蛋白含量。蛋白樣品中加入適量的上樣緩沖液，于100℃水浴鍋中煮沸10 min后進行SDS-PAGE，然后恒流轉膜2 h。將轉好蛋白的PVDF膜置于TBST配置的5%脫脂奶粉中封閉1～2 h，加入一抗4℃孵育過夜，接著加入含辣根過氧化物酶的二抗常溫孵育，ECL化學發光液反應，凝膠成像儀成像顯影，拍攝蛋白條帶結果。

1.7 統計學方法

采用GraphPad Prism 7.0對實驗數據進行統計學分析檢驗，實驗數據用x±s表示，組內兩兩比較采用LSD-t分析，組間比較采用單因素或雙因素方差分析，檢測水平α＜0.05（雙側），Shapiro-Wilk檢測實驗數據均服從正態分布。P＜0.05表示有顯著性差異，具有統計學意義。

2 結果

2.1 SNHG16在肺癌組織和肺癌細胞系中高表達

采用qRT-PCR檢測SNHG16在肺癌組織和細胞系中表達量，結果見圖1，Shapiro-Wilk檢測實驗結果符合正態分布（均P＞0.05）。結果顯示，SNHG16在肺癌組織和肺癌細胞系中表達量均明顯高于相應的癌旁組織和正常肺上皮細胞系，差異具有統計學意義。

2.2 敲低SNHG16抑制NCI-H1395細胞增殖率和對吉西他濱耐藥

慢病毒包裝構建sh-SNHG16-1、sh-SNHG16-2，分為sh-NC組、sh-SNHG16-1組、sh-SNHG16-2組，采用qRT-PCR檢測各組NCI-H1395細胞中SNHG16的表達量，結果見圖2A，Shapiro-Wilk檢測實驗結果符合正態分布（均P＞0.05）。采用CCK-8檢測3組NCI-H1395細胞增殖率，結果見圖2B，Shapiro-Wilk檢測實驗結果符合正態分布（均P＞0.05）。sh-SNHG16-1、sh-SNHG16-2組細胞增殖率在12、24和48 h時明顯低于sh-NC組，F時間=574，F組別=128.8，F時間×組別=16.7，均P＜0.001。采用CCK-8檢測3組NCI-H1395對吉西他濱耐藥的影響，結果見圖2C，Shapiro-Wilk檢測實驗結果符合正態分布（均P＞0.05）。sh-SNHG16-1、sh-SNHG16-2組細胞存活率在吉西他濱濃度分別為5、10和 20 μmol/L時明顯低于 sh-NC 組，F濃度=320.5，P＜0.001，F組別=44.83，P＜0.001，F濃度×組別=3.562，P=0.0053。以上結果表明，sh-SNHG16敲低SNHG16的表達量，抑制NCI-H1395細胞增殖率和對吉西他濱耐藥，差異具有統計學意義。

2.3 SNHG16作為海綿抑制miR-520a-3p的表達

用starBase軟件預測靶向SNHG16的miRNA，分為Vector組、SNGH16組，qRT-PCR檢測各組miRNA的表達量，結果見圖3A，Shapiro-Wilk檢測實驗結果符合正態分布（均P＞0.05）。雙螢光素酶報告基因實驗檢測miR-NC、miR-520a-3p mimics組SNHG16野生型和突變型的相對雙螢光素酶活性，結果見圖3B，Shapiro-Wilk檢測實驗結果符合正態分布（均P＞0.05）。圖3C為SNHG16野生型與miR-520a-3p結合位點。結果表明，增加SNHG16的表達明顯降低miR-520a-3p的表達，增加miR-520a-3p的表達明顯降低SNHG16野生型的相對螢光素酶活性，證明SNHG16作為海綿抑制miR-520a-3p的表達，差異結果均具有統計學意義。

圖1 SNHG16在肺癌組織和肺癌細胞系中的表達量

圖2 敲低SNHG16對NCI-H1395細胞增殖率及吉西他濱耐藥的影響

圖3 SNHG16作為海綿抑制miR-520a-3p的表達

2.4 SNHG16/miR-520a-3p對NCI-H1395細胞增殖率和對吉西他濱耐藥的影響

分為sh-NC組、sh-SNHG16組、sh-SNHG16+miR-520a-3p-inhibitor組，qRT-PCR檢測各組NCI-H1395細胞中miR-520a-3p的表達量，結果見圖4A，Shapiro-Wilk檢測實驗結果符合正態分布（均P＞0.05）。采用CCK-8檢測3組NCI-H1395細胞增殖率，結果見圖4B，Shapiro-Wilk檢測實驗結果符合正態分布（均P＞0.05）。sh-SNHG16組細胞增殖率在12、24和48 h時明顯低于sh-NC組，sh-SNHG16+miR-520a-3p-inhibitor組相比sh-NC組各時間細胞增殖率沒有統計學差異（P＞0.05），F時間=1177，F組別=178.3，F時間×組別=39.93，均P＜0.001。采用CCK-8檢測3組NCI-H1395對吉西他濱耐藥的影響，結果見圖4C，Shapiro-Wilk檢測實驗結果符合正態分布（均P＞0.05）。sh-SNHG16組細胞存活率在吉西他濱濃度分別為5、10和20 μmol/L時明顯低于sh-NC組，sh-SNHG16+miR-520a-3p-inhibitor組相比sh-NC組各濃度對吉西他濱耐藥沒有統計學差異（P＞0.05），F濃度=231.7，P＜0.001，F組別=27.86，P＜0.001，F濃度×組別=2.391，P=0.042。采用蛋白質印跡檢測 MRP1、MRP2、ABCG2轉運蛋白的表達水平，結果見圖4D。sh-SNHG16組3種轉運蛋白表達水平明顯低于sh-NC組，sh-SNHG16+miR-520a-3p-inhibitor組與sh-NC組相比沒有明顯差異。以上結果表明，sh-SNHG16通過上調miR-520a-3p的表達量，抑制NCI-H1395細胞增殖率和對吉西他濱耐藥，差異具有統計學意義。

圖4 SNHG16/miR-520a-3p對NCI-H1395細胞增殖率和對吉西他濱耐藥的影響

3 討論

肺癌在所有癌癥死亡因素中居首位，每年死于肺癌的人數占癌癥死亡人數的18%～25%[2,10]。lncRNA是一類不編碼蛋白的長鏈RNA，研究表明其在腫瘤的發生發展過程中起重要作用，通過多種機制調控靶基因，包括轉錄和轉錄后加工、染色質修飾和蛋白質功能，從而參與人類癌癥的發生發展[8]。SNHG16屬于lncRNA中小核仁RNA宿主基因家族，研究表明其表達量與腫瘤分期分型、患者預后及生存率有關[6,8,11]。SNHG16在卵巢癌中高表達，與卵巢癌分期、遠處轉移和預后不良有關，SNHG16能夠激活AKT磷酸化，上調MMP9的表達，促進卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷移[12]。沉默SNHG16促進細胞周期停滯和凋亡，抑制膀胱癌細胞的增殖[8]。SNHG16在乳腺癌組織中的表達水平高于相應的非癌組織，其通過競爭性結合miR-98誘導乳腺癌細胞遷移[13]。SNHG16在宮頸癌中作為癌基因，可通過作為內源性“海綿”來調節miR-216a-5p/ZEB1，從而促進腫瘤的進展[14]。SNHG16在結直腸癌中表達顯著上調，其表達與Wnt調控的轉錄因子ASCL2、ETS2和cMyc的表達呈正相關，敲低Wnt信號可降低SNHG16的表達，表明SNHG16受Wnt信號通路調控[7]。SNHG16過表達能夠抑制肝癌細胞增殖、5-氟尿嘧啶耐藥和體內腫瘤生長。

本研究主要探討肺癌中SNHG16的表達量對化療耐藥影響的作用機制。前期研究結果表明，SNHG16在肺癌中的表達量明顯高于癌旁組織，其在肺癌細胞系中的表達量也明顯高于正常肺上皮細胞。我們在肺癌細胞系中敲低SNHG16的表達，降低了細胞增殖和對化療藥物吉西他濱的耐藥，提示SNHG16可能在肺癌中作為癌基因促進癌細胞的增殖和對化療的耐藥。

為進一步探究SNHG16調控肺癌細胞增殖和耐藥的作用機制，我們通過軟件預測SNHG16作為海綿拮抗miR-520a-3p的表達，其在肺癌中的表達與SNHG16呈負相關，并采用螢光素酶報告基因實驗驗證了該結果，證實SNHG16靶向作用miR-520a-3p。在肺癌細胞中，同時敲低SNHG16和miR-520a-3p的表達，可降低細胞增殖和對化療藥物吉西他濱耐藥的影響結果。此外，敲低SNHG16明顯增加miR-520a-3p的表達量，說明敲低SNHG16抑制肺癌細胞增殖和化療耐藥通過增加miR-520a-3p的表達量實現。研究發現，miR-520a-3p在非小細胞肺癌（NSCLC）和小細胞肺癌（SCLC）中表達下調，miRNA-520a-3p通過靶向HOXD8抑制NSCLC細胞的增殖和腫瘤干細胞表型，逆轉吉非替尼耐藥性[15]。lncRNA能夠靶向miRNA，影響miRNA生物功能，如LINC01116通過靶向miR-520a-3p上調骨肉瘤中IL-6R的表達，激活JAK-STAT信號通路，促進骨肉瘤進展[16]。

綜上，SNHG16在肺癌組織和細胞中高表達，并通過“海綿”作用抑制miR-520a-3p的表達，從而促進肺癌細胞增殖和耐藥。但是，目前尚不清楚SNHG16調控肺癌增殖和化療耐藥的具體作用機制，須進一步探討。SNHG16可以作為肺癌治療的潛在作用靶點。