骨髓間充質干細胞外泌體miR-190a-5p通過靶向KLF15抑制肺癌細胞遷移和侵襲

劉克強，姜晶晶，馬靜波，譚健，丁萌萌，張衛強，裴迎新，趙京

解放軍總醫院 a.第七醫學中心胸外科，北京 100700；b.京西醫療區廂紅旗門診部，北京 100091

肺癌是常見腫瘤之一，是癌癥相關死亡的主要原因，發病率和死亡率均居首位[1]。研究表明，骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）能夠轉移到腫瘤組織[2]，并通過外泌體的形式影響腫瘤組織的發生發展[3-5]。外泌體是30～150 nm大小，由膜包被的囊泡，可以運輸蛋白質、脂質和核酸等物質到受體細胞。最近，BMSCs外泌體已被證明可將功能性RNA轉移到受體細胞，特別是，外泌體可以攜帶參與癌細胞增殖、分化和凋亡的microRNA（miRNA）[6-7]，且外泌體中的特異性miRNA水平升高與癌癥進展有關[8-10]，如BMSCs來源的外泌體miR-126-3p通過調控ADAM9的表達抑制胰腺癌的進展[11]。miR-190a-5p在各類型癌癥中的作用鮮見探究，通過靶基因預測軟件發現Krüppel樣因子15（Krüppel-like factor15，KLF15）可 能 是 miR-190a-5p的靶基因。已知KLF15是KLFs家族中的一種轉錄因子，在多種類型的癌癥，如肺癌[12-13]、胃癌[14]等中發揮功能，抑制KLF15表達會促進腫瘤發生[15-16]。因此，本研究探究了miR-190a-5p在肺癌細胞、BMSCs及其外泌體中的含量差異，以及BMSCs外泌體miR-190a-5p對肺癌細胞KLF15的表達調控，繼而探討對肺癌細胞遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

肺癌細胞系 A549、LK79、H1975和 HCC827，人正常上皮細胞BEAS-2B購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；人BMSCs購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；DMEM培養基、TRIzol試劑、Super-ScriptⅡ逆轉錄酶試劑盒及SYBR Green Master Mix購自Thermo Fisher Scientific公司；CD63、CD9、HSP70、KLF15及 GAPDH 抗體購自Abcam公司；All-in-one miRNA qRT-PCR檢測試劑盒購自GeneCopoeia公司；LipofectAMINE 2000轉染試劑購自Invitrogen公司；雙螢光素酶報告試劑盒購自Promega公司；PVDF膜購自Millipore公司；Transwell小室購自BD公司；化學顯色劑購自Bio-Rad公司；透射電子顯微鏡為日立公司產品。

1.2 外泌體的分離與鑒定

待BMSCs生長融合至80%后，用PBS漂洗，再放至含有無外泌體胎牛血清的DMEM培養基中培養2 d。采用超速離心法提取外泌體[11]，首先收集細胞培養液，500 r/min離心12 min去除細胞，然后5000 r/min離心30 min去除細胞碎片。將上清液通過220 nm濾膜過濾，過濾后的濾液低溫超速離心2 h，取沉淀并溶解在PBS中以備后續實驗使用。用透射電鏡觀察外泌體形態。取1 mL外泌體重懸液，用Nanosight NS300分析儀檢測外泌體粒徑分布，并采用蛋白印跡法檢測外泌體特異性標志蛋白CD63、CD9及HSP70[17]以鑒定外泌體。

1.3 外泌體處理細胞

處理前24 h將肺癌細胞植入6孔板，當細胞生長融合至70%時，將200 μL外泌體直接添加到6孔板中，與細胞共孵育48 h，對照組加入PBS，最后收集細胞進行實驗[18]。

1.4 細胞轉染

轉染前24 h將肺癌細胞接種于6孔板（2×105/孔），當細胞融合率達60%～80%時進行轉染，按照說明書使用LipofectAMINE2000轉染10 nmol/L miR-190a-5p mimics［5'-UGAUAUGUUU GAUAUAUUAGGU-3'（sense鏈）］、miR-190a-5p inhibitor［5'-ACCUAAUAUAUCAAACAUAUCA-3'（sense鏈）］。

1.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

TRIzol法提取總RNA，然后采用Super-ScriptⅡ逆轉錄酶試劑盒對RNA進行逆轉錄，采用SYBR GreenMasterMix進行qRT-PCR檢測KLF15的相對含量，以GAPDH為內參。利用Allin-one miRNA qRT-PCR檢測試劑盒檢測miR-190a-5p 的表達，以 U6 為內參。通過 2-ΔΔCt方法將基因表達進行標準化。各基因qRT-PCR引物序列見表1。

1.6 雙螢光素酶報告基因檢測

將肺癌細胞接種于24孔板，24 h后與KLF15野生型或突變型的螢光素酶報告基因質粒、miR-190a-5p模擬物或對照共轉染，24 h后收集細胞，用雙螢光素酶報告試劑盒分析各組細胞的發光值，每組3個重復。

表1 qRT-PCR引物及序列

圖1 BMSCs外泌體鑒定

1.7 蛋白印跡法分析

經含蛋白酶抑制劑的裂解液裂解后，11 000 r/min離心20 min，取上清加入變性緩沖液混勻，沸水浴5 min。變性蛋白樣品經SDS-PAGE分離后電轉到PVDF膜上，用PBST配制5%的脫脂牛奶封閉，隨后加入一抗（1∶10 000）于4℃孵育過夜，TBST清洗后，用辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5000）孵育1 h。在膜上加入化學顯色劑，反應5 min，放置在凝膠顯影儀中曝光成像。

1.8 細胞遷移與侵襲實驗

Transwell法檢測細胞遷移。將Transwell小室放入24孔板中，上室加入2×105細胞，下室加入細胞遷移趨化物500 μL培養基，每組3個重復，在37℃、5% CO2條件下培養48 h后取出小室，DPAI染色，顯微鏡觀察，拍照，計數。

Transwell侵襲試驗是將稀釋后的Matrigel基質凝膠加到上室，其余步驟與Transwell遷移實驗相同。

1.9 統計學方法

應用GraphPad Prism 7進行統計學分析。計量數據以x±s表示，經S-W檢驗均符合正態分布。2獨立組均值間差異采用t檢驗，3組以上的組間比較采用方差分析法（One Way ANOVA），2因素數據進行2因素檢驗分析，組內兩兩多重比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05（雙側）。

2 結果

2.1 BMSCs外泌體鑒定

如圖1，BMSCs外泌體多呈圓形，納米顆粒示蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）表明顆粒直徑多介于100～200 nm。以提取外泌體過程中得到的細胞碎片為對照，蛋白印跡法檢測外泌體表面標志物CD63、CD9和HSP70，結果顯示分離得到的外泌體組中3種標志蛋白均表達。

2.2 miR-190a-5p在BMSCs外泌體中高表達

圖2A結果顯示，4種肺癌細胞A549、LK79、H1975、HCC827中miR-190a-5p相對表達量均低于正常肺細胞BEAS-2B，差異具有統計學意義；而BMSCs中miR-190a-5p相對表達量高于肺癌細胞系和BEAS-2B，差異具有統計學意義。為了進一步檢測miR-190a-5p是否存在于外泌體中，選取4肺癌細胞中miR-190a-5p表達相對最高的A549外泌體，對比正常肺細胞BEAS-2B外泌體和BMSCs外泌體，發現BMSCs外泌體中miR-190a-5p含量也明顯高于BEAS-2B和肺癌細胞A549，差異均具有統計學意義（圖2B）。該結果提示，miR-190a-5p在肺癌細胞中下調表達，而在BMSCs外泌體中高表達。

2.3 miR-190a-5p靶向調控KLF15表達

為了探究miR-190a-5p在肺癌中的作用機制，我們通過Targetsan預測發現KLF15可能是miR-190a-5p的作用靶基因。隨后通過螢光素酶報告基因檢測發現，在肺癌細胞LK79和H1975中過表達miR-190a-5p均抑制了野生型KLF15 3'UTR螢光素酶活性，差異具有統計學意義，但是對突變型KLF15 3'UTR卻沒有影響。進一步檢測miR-190a-5p對KLF15表達的影響發現，過表達miR-190a-5p降低了肺癌細胞中KLF15的mRNA和蛋白表達水平，差異有統計學意義。該結果提示，miR-190a-5p可能通過靶向調控KLF15的表達，從而影響肺癌進展。結果見圖3。

圖2 miR-190a-5p在細胞及其外泌體中的表達

2.4 KLF15促進肺癌細胞的遷移和侵襲

為了探究KLF15在肺癌細胞中的功能，將shKLF15分別轉染肺癌細胞LK79和H1975，肺癌細胞中KLF15的蛋白表達被抑制。Transwell結果顯示，敲低KLF15抑制了肺癌細胞LK79和H1975的遷移和侵襲，也說明KLF15能夠促進肺癌細胞的遷移和侵襲（圖4）。

2.5 BMSCs外泌體miR-190a-5p抑制肺癌細胞遷移和侵襲

圖5結果顯示，BMSCs外泌體和miR-190a-5p mimics均使肺癌細胞中miR-190a-5p含量升高，抑制了KLF15的mRNA和蛋白表達，肺癌細胞遷移和侵襲細胞胞數量減少；而miR-190a-5p inhibitor能夠減弱BMSCs外泌體miR-190a-5p對KLF15表達和對肺癌細胞遷移侵襲的的抑制作用。該結果提示BMSCs外泌體miR-190a-5p能夠通過提高肺癌細胞中的miR-190a-5p含量，抑制KLF15表達，從而抑制肺癌細胞的遷移和侵襲。

3 討論

作為發生率和死亡率均是世界第一的肺癌，其整體5年生存率低于18%，因此，探究肺癌新的診斷治療策略仍至關重要。研究表明，BMSCs能夠轉移到腫瘤組織[2]，并通過外泌體的形式影響腫瘤組織的發生發展[3-5]。miRNAs因其能夠作為癌癥生物標志物，以及與腫瘤發生、細胞增殖、分化和凋亡等多種生理和病理發展密切相關而備受關注[7,19-22]。本研究明確了BMSCs來源的外泌體miR-190a-5p對肺癌細胞生物學功能的影響。

圖3 miR-190a-5p靶向調控KLF15表達。

圖4 KLF15促進肺癌細胞的遷移和侵襲

通過starBase在線分析，我們發現miR-190a-5p在肺癌組織中低表達，與本研究結果一致，miR-190a-5p在肺癌細胞中的表達含量低于正常肺細胞，而在BMSCs中miR-190a-5p表達含量顯著高于正常肺細胞，且不同細胞外泌體中miR-190a-5p的含量檢測結果與細胞檢測結果一致。本研究推測BMSCs可以通過外泌體的形式運輸miR-190a-5p參與肺癌細胞功能。

但miR-190a-5p影響肺癌細胞生物學功能的機制仍不清楚，因此我們通過Targetscan靶基因預測軟件以及螢光素酶報告基因檢測證明KLF15是miR-190a-5p的靶基因，miR-190a-5p能夠靶向抑制KLF15的表達。一些研究表明，KLFs家族成員參與細胞的多種生物學功能[23-24]，如細胞增殖、分化和凋亡。KLF15參與多種腫瘤發生發展，但在不同腫瘤甚至同種腫瘤中的研究結果也存在差異，如Sun等[14]發現KLF15通過上調CDKN1A/p21和CDKN1C/p57的表達來抑制胃癌細胞的增殖；Wang等[12]的研究結果顯示KLF15能夠抑制肺腺癌細胞生長；但也有研究顯示KLF15能夠促進肺腺癌細胞增殖和遷移[13]。本研究結果表明KLF15能夠促進肺癌細胞的遷移和侵襲，且KLF15的表達受miR-190a-5p靶向調控。

圖5 BMSCs外泌體miR-190a-5p抑制KLF15的表達并促進肺癌細胞遷移和侵襲

本研究發現miR-190a-5p在BMSCs外泌體中的含量很高，為了探究BMSCs外泌體miR-190a-5p是否會影響肺癌細胞中的miR-190a-5p含量，并參與肺癌細胞的生物學功能，因此本研究將BMSCs外泌體與肺癌細胞共培養，發現BMSCs外泌體組與miR-190a-5p mimic組一樣會使肺癌細胞中miR-190a-5p含量增加，抑制KLF15表達，抑制肺癌細胞的遷移和侵襲，且miR-190a-5p inhibitor能夠減弱BMSCs外泌體miR-190a-5p對KLF15表達和對肺癌細胞遷移侵襲的抑制作用。因此，雖然miR-190a-5p在肺癌細胞中含量較低，但BMSCs外泌體miR-190a-5p可以提高肺癌細胞中的miR-190a-5p含量，從而抑制KLF15表達，抑制肺癌細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，BMSCs外泌體miR-190a-5p能夠增加肺癌細胞中的miR-190a-5p含量，靶向抑制KLF15的表達，抑制肺癌細胞遷移和侵襲，為肺癌的診斷和治療提供了新的思路。