一種改進的小鼠嗅神經元原代培養方法及其鑒定*

田 俊,張三妹,李 麗

(1.山西醫科大學第一醫院耳鼻喉科，太原 030001； 2.山西大醫院老年腫瘤科，太原 030032； 3.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院耳鼻喉科，北京 100020)

嗅神經元是氣味感受的受體神經元，分布于鼻腔嗅黏膜區域。由于小鼠嗅區組織量非常少，而且早期嗅神經元的死亡幾乎不可避免，小鼠嗅神經元原代培養成功率仍然很低。目前，大腦星形膠質細胞常作為原代培養嗅神經元的飼層細胞為離體的嗅神經元提供營養支持[1-3]，然而，這類方法需要在培養嗅神經元之前的7～10 d接種好星形膠質細胞，并且操作過程復雜，成功率不穩定，同時飼層細胞的引入增加了后續嗅神經元純化的難度。本研究介紹了一種改進的胚鼠嗅神經元原代培養方法，不通過飼養層細胞而獲得具有典型雙極神經元形態的嗅神經元，為嗅覺功能的體外研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料 嗅神經元培養基：100 mL Waymouth′s MB752/1培養基(1×,Life Technologeis公司)，1 mL N2添加劑(100×,Life Technologies公司)，100 μL慶大霉素(50 mg/mL,Life Technologies公司)，不含鈣鎂的Hank′s平衡鹽溶液/N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(HBSS/HEPES)液50 mL(10×)，5 mL 1 mol/L HEPES(pH 7.2)，5 mL青霉素-鏈霉素溶液(Life Technologies公司)，加水至500 mL。

1.2方法 目前原代嗅神經元培養的主要步驟差別不大，通過比較這些方法后本研究以GONG等[4]介紹的方法為主進行改良，主要步驟如下。

1.2.1嗅黏膜取材 取孕15～20 d C57BL/6小鼠(購自北京維通利華實驗動物有限公司，北京)的胚胎嗅神經元進行原代培養。將孕鼠腹腔戊巴比妥鈉麻醉后脫臼處死，乙醇浸泡后移入超凈臺，取出胚胎置于HBSS/HEPES液中，見圖1A。依次取出胚胎，斷頭后在體式顯微鏡下沿頭部正中切開，顯露并切取嗅黏膜，仔細去除黏膜下的骨質，見圖1B。

1.2.2嗅黏膜的分離 將嗅黏膜置于HBSS/HEPES液稀釋的2 mg/mL中性蛋白酶中37 ℃消化40 min，使嗅上皮和其基質松解，在顯微鏡下仔細去除混濁粘連的基質部位，見圖1C。

1.2.3嗅神經元的分離和接種 將分離的小塊狀嗅上皮移入嗅神經元培養基中(圖1 D)，37 ℃ 5% CO2培養箱孵育3 h。為避免成纖維等雜細胞的污染，嗅上皮不再進一步消化。將孵育好的嗅上皮及培養基移入15 mL離心管中輕柔吹打10～15次。加入2 μL胎牛血清終止反應后靜置1～2 min，吸取非沉淀部分，2 000 r/min 離心5 min，用新的培養基重懸后以5×104個/cm2接種至35 mm細胞培養皿(康寧)，2 mL/皿，共6皿。用于激光共聚焦顯微鏡觀察的神經元接種于玻璃底的專用培養皿上。

1.2.4換液 接種后的24 h以及之后的每天，用新鮮配制的溫培養基更換50%舊的培養基。

A:取出小鼠胚胎置于培養液中;B:頭部正中切開，顯露并切取嗅、黏膜(黑線條標記區域)；C:中性蛋白酶中37 ℃消化40 min,嗅黏膜神經上皮層與基質分離；D:分離后的嗅上皮

圖1嗅神經元的分離過程

1.2.5嗅神經元常規分離步驟 將嗅上皮小塊轉移至15 mL離心管中，2 000 r/min 離心2 min；吸掉培養基，加入1 mL溫和胰酶消化(0.5 mmol/L乙二胺四乙酸)，重懸后10 min 37 ℃水浴孵育；110 μL胎牛血清終止反應；用尖端0.3 mm巴斯德吸管吹打10～15次；2 000 r/min 離心5 min，棄上清后加入0.5 mL培養基后接種。

1.2.6嗅神經元的觀察及鑒定 在用兩種方法接種后的第1、3、5、7和9天，倒置顯微鏡(LEICA 4000B,德國)觀察細胞形態。隨機選擇5個高倍視野，記錄典型嗅神經元的個數。培養第5天時，采用標準的免疫熒光方法對嗅神經元進行鑒定，神經元特異的β微管蛋白Ⅲ抗體為雞抗鼠多克隆抗體(Abcam Hong Kong Ltd,香港)，工作濃度1∶200，成熟嗅神經元特異表達的嗅神經元標志蛋白(olfactory marker protein,OMP)為兔抗鼠多克隆抗體(Abcam Hong Kong Ltd,香港)，工作濃度1∶200。激光共聚焦顯微鏡(Leica Microsystems TCS SP5,美國)觀察結果。

2 結 果

通過倒置顯微鏡下的連續觀察，按照改進的實驗流程，在離體接種后24 h內大部分的細胞死亡，存活的細胞部分形態不典型(圖2A)，部分存活細胞則顯示出了典型的雙極神經元形態，包括圓形的胞體，一個短粗的樹突和一個細長的軸突(圖2A、B)。雖然每個神經元只能觀察到一個軸突，但軸突的末端，可以觀察到分支。當神經元相互接近的時候，更容易觀察到這種分支。在接種后的第5天，這些細胞經過β微管蛋白Ⅲ和(圖2C)嗅神經元標志蛋白(OMP)免疫熒光標記證實為嗅神經元(圖2D)。在激光共聚焦顯微鏡下，可以觀察到神經元之間的突觸連接，部分嗅神經元可觀察到嗅纖毛、細長的軸突。在接種后第9天，仍可觀察到存活的嗅神經元能夠保持其典型的雙極形態，見圖2、3。

采用普通的培養流程，在離體接種后的24 h內可見大部分的細胞死亡。在接種后的第1、3天，兩種培養方法存活嗅神經元的數量比較差異無統計學意義[第1天，(6.4±1.8)vs. (4.6±1.1)個/高倍視野，P=0.10；第3天，(6.2±1.3)vs. (5.6±2.1)個/高倍視野，P=0.60]。不規則成纖維細胞開始生長，接種第5天，可見不規則的成纖維細胞長滿了培養皿，僅可見散在的嗅神經元，見圖4。

A：接種后24 h嗅神經元形態(×100)；B：高倍鏡下典型嗅神經元形態(×400)；C：接種后第5天激光共聚焦顯微鏡下β微管蛋白Ⅲ免疫熒光標記嗅神經元(×800)；D：接種后第5天激光共聚焦顯微鏡下OMP免疫熒光標記嗅神經元(×800)

圖2改進方法原代培養的嗅神經元觀察及免疫熒光鑒定

圖3 改進方法原代培養的嗅神經元接種后第9天的形態觀察(×100)

A.接種后第3天嗅神經元形態，可見不規則形態的成纖維細胞開始生長；B.接種后第5天嗅神經元形態，可見不規則形態的成纖維細胞幾乎鋪滿培養皿，無法觀察到典型的嗅神經元

圖4普通方法原代培養的嗅神經元接種后第3、5天形態觀察(×100)

3 討 論

本研究在沒有星形膠質細胞作為飼養層細胞的情況下，通過對嗅神經元分離步驟的改進，成功體外培養了嗅神經元，部分神經元具有典型的雙極神經元形態，包括圓形的胞體，一個短粗的樹突和一個細長的軸突，并表達OMP和神經元特異的β微管蛋白Ⅲ。這些離體的嗅神經元在體外存活10 d左右。同樣在沒有飼養層細胞的培養條件下，當采用一般的步驟進行原代嗅神經元培養時，在培養第3天，可觀察到明顯的成纖維細胞的污染，由于具備體外增殖能力，成纖維細胞幾乎可以鋪滿培養皿，影響嗅神經元的生長和分離。

目前嗅神經元的原代培養技術并未成熟，操作步驟復雜、耗時長，對操作人員技術水平要求很高，神經元的存活率不高，受多種因素的影響，實驗的穩定性較差[5-7]。

在神經元體外培養系統中，常用培養的單層神經膠質細胞作為神經元的底物。神經膠質細胞的突起可引起神經元的遷移和神經突起的生長，同時提供促進神經元存活的營養物質，促進神經元良好地發育[8-10]。GONG等[4]分離純化新生小鼠星形膠質細胞，鋪滿培養皿后作為飼養層細胞再接種嗅神經元。在嗅神經元接種后的第3～5天，細胞的存活率為20%～30%，可見即使有飼養層細胞，嗅神經元很容易受到外界條件的影響而死亡。而飼養層細胞的加入，增加了操作的時間，增大了非目標細胞的污染，還可能會對后續嗅神經元的觀察、分離、純化或其他實驗步驟產生干擾。通過本研究采用的改進步驟，在沒有飼養層細胞的情況下，嗅神經元仍然能夠保持一定的存活數量，并且生長出典型的軸突和樹突。說明飼養層細胞并非是嗅神經元原代培養所必需。

目前報道的各種嗅神經元原代培養方法，主要步驟包括嗅黏膜的取材，嗅上皮的分離和嗅神經元的分離，時間可能超過8 h。將嗅神經元的前體細胞從嗅上皮分離是原代培養的關鍵步驟。如何減少嗅神經元分離過程試劑、操作、從離體到接種的時間對神經元活性的影響，仍需要不斷地探索。本研究的改進主要在嗅神經元的分離步驟，通過去掉再次酶消化，用靜置代替一次離心操作減輕操作本身對神經元活性的影響，同時縮短嗅神經元離體的時間來保存細胞的生物活性，結果表明這種改進是有效的。

分離神經細胞的原代培養常含有異質性的細胞群體，在通常的實驗方法中，在嗅上皮37 ℃孵育2～3 h促進嗅神經元向嗅上皮表面移動后，為了獲得足夠數量的神經元，通常繼續用酶消化上皮10 min以促進神經元更容易與支持細胞等脫離。而酶本身既影響嗅神經元的活性，同時也可能將嗅黏膜固有層未完全分離的其他組織類型細胞間的連接松解，在隨后的分離步驟中混入嗅神經元中。本研究證實采用這種分離方法會使固有層中的成纖維細胞混入，雖然在接種后的2 d內對嗅神經元的影響不大，但由于成纖維細胞具有較強的增殖能力而嗅神經元不能增殖，3 d后可見到明顯增殖的成纖維細胞，直至鋪滿培養皿。雖然充分分離嗅上皮和其下方的固有層理論上可以避免該污染的發生，但在實際中由于操作難度大而很難規避這一風險。

嗅覺功能的研究離不開嗅神經元的原代培養，由于嗅神經元自身的特點，或是因為相關原代培養技術的局限，現有的培養技術還遠未滿足科研的需要。通過對嗅神經元分離步驟的改進，本研究成功建立了一種相對簡便的嗅神經元原代培養方法，為嗅神經元功能及嗅覺障礙相關疾病的基礎研究提供了體外實驗體系。

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