肺癌循環腫瘤細胞檢測及臨床應用的研究進展*

何文杰，王羽豐，李 佳，李繼鵬 綜述，江 波審校

(1.昆明醫科大學第三附屬醫院干部醫療科 650118；2.昆明醫科大學第四附屬醫院急診內科 650031)

每一年全球新發肺癌患者160萬人，因肺癌死亡患者140萬人[1]。多數肺癌患者就診時已為晚期，常伴發有一個甚至多個器官的轉移。90%肺癌患者并非死于原發腫瘤，而是因轉移灶引起器官衰竭而死亡[2]。當前，無論是影像學還是血清腫瘤標志物都難以及時而精準地預測腫瘤轉移的發生、發展。因此，建立一種精準、便捷、能動態監測腫瘤發生、發展的診斷方法，成為全球肺癌研究領域關注的熱點。

19世紀末期，PAGET提出了腫瘤轉移的“種子與土壤”學說，認為攜帶腫瘤細胞的種子能夠從原發腫瘤脫落轉移到遠處器官的土壤中繼續生存。依據這一學說，提出了循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)的概念，即由原發腫瘤或轉移腫瘤脫落后進入到循環血液中，具有腫瘤基因特征或腫瘤抗原特性的惡性腫瘤細胞[3]。當前的研究顯示，在發生轉移之前，惡性腫瘤細胞就可釋放CTCs通過上皮細胞間充質化進入轉移器官中[4]。CTCs可作為肺癌早期診斷、評價療效及預后、檢測轉移及復發的重要指標，也可檢測肺癌驅動基因的突變狀態，指導肺癌的靶向治療。但CTCs檢測的精確性、科學性在學術界仍存在爭議，仍需進一步的研究和探索。

本文主要總結了當前CTCs的檢測方法及在肺癌中應用的現狀及前景及CTCs的特性與肺癌轉移的相關性問題。同時也突顯出了當前CTCs在肺癌診斷、治療中得到廣泛臨床認可及推廣需要解決的問題。

1 CTCs的檢測方法

當前CTCs檢測技術主要分為富集技術和分析技術兩大方面。

1.1富集技術

1.1.1基于形態學的分離法 基于腫瘤細胞與正常血細胞相比，有更大的體積(>8 μm)、不同的密度及形態的原理，建立了基于CTCs形態學的分離法。包括基于腫瘤細胞大小的分離法(isolation by size of epithelial tumor cells，ISET)和密度梯度法。

首先建立的是ISET法，其通過一定孔徑的聚碳酸酯膜設計腫瘤分子屏障，依據腫瘤細胞較正常血細胞直徑大的原理分離CTCs。通過物理特性的原理分離出的CTCs形態完整，細胞的特性得以完整保存，其表達的抗原未遭破壞，提高了后續免疫標記、染色等的可行性和準確性。但外周血中的也存在著許多大分子的細胞，同時部分CTCs體積較血細胞相似甚至更小，從而降低了該檢測方法的靈敏度和特異度。

密度梯度法依據腫瘤細胞與正常血細胞不同的密度差，通過離心的方式將血液分層為血清、白細胞、CTCs和單核細胞、紅細胞等。該方法操作簡便、易行，對設備、試劑要求較低，但離心過程中容易使CTCs與單核細胞混入血漿層或積聚成團混入紅細胞層。有鑒于此，改進后的Oncoquick法，通過放置多孔膜在分離液與血液之間，防止交叉混合，從而降低CTCs的損失率。而RosetteSepTM法，通過抗體交聯的方式與不需要的血細胞交聯，增加其密度，離心后使其沉降到最底層，從而容易被去除。該方法能夠極大提高CTCs的富集率。

1.1.2免疫磁性分離法 免疫磁性分離法是當前認可度最高的CTCs富集方法。其工作原理為上皮來源的腫瘤細胞一般都表達上皮黏附分子(EpCAM)和細胞角蛋白(CK)，而這些分子在血細胞中是不表達的。同時，一些腫瘤具有特異性的腫瘤標志物，例如Her2-neu、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)等。將這些特異性的分子抗體與免疫磁珠結合，形成陽性免疫磁珠，與腫瘤細胞特異性抗原相結合，通過磁場的作用被吸附出來。另外，將含有特異性白細胞表面抗體如CD45抗體與免疫磁珠結合，形成陰性免疫磁珠，消除血細胞中的白細胞,有利于之后針對CTCs的免疫細胞化學和免疫熒光分析檢測[5]。但在循環系統中，上皮特異性抗體可標記非腫瘤性的上皮細胞，從而增加了假陽性結果。同時，免疫磁性檢測方法，對檢測設備、實驗條件要求較高，檢測步驟繁瑣，費用昂貴，這也限制了其在臨床工作中的推廣和應用。

1.2分析技術

1.2.1基于免疫細胞化學的分析技術 免疫細胞化學法是將待檢測的細胞固定后，與帶有熒光的上皮性腫瘤細胞特異性抗原如EpCAM、CK的抗體結合，依據抗原抗體的反應，檢測CTCs的存在及數量。同時，加入特殊的抗白細胞抗體來排除假陽性的發生。當前常用的檢測方法有流式細胞技術、光纖陣列掃描技術(fiber-optic array scanning technology,FAST)、酶聯免疫斑點檢測技術(enzyme-linked epithelial immunospot assay,EPISPOT)。

流式細胞術是一種利用識別熒光染色的單克隆抗體標記的腫瘤細胞,來分析和檢測富集后分離的CTCs的技術。其具有高效、快速、精確的特性。此外，流式細胞術還能夠同期對CTCs進行細胞大小、形態、細胞內外標記物、DNA特性等多參數分析[6]。

FAST是一種更為高效、快速的流式細胞技術。通過配備一個50 341 mm的分析視野，其掃描、分析熒光標記的CTCs的速率是常規檢測方法的500倍。MARRINUCCI等[7]研究顯示，在晚期大腸癌患者中，FAST與傳統流式細胞術、反轉錄PCR比較，能夠更為快速地發現更多數量的CTCs。目前該方法多用于小樣本量臨床試驗階段。

EPISPO首先利用免疫陽性磁珠分離出帶有腫瘤特異性抗原的細胞，利用免疫陰性磁珠去除血液中的白細胞。之后與帶有熒光標記的抗體結合，利用熒光檢測方法分析分泌腫瘤特異性蛋白的CTCs[8]。

1.2.2基于核酸的分析技術 反轉錄PCR是目前廣泛用于肺癌CTCs分析的技術之一，其主要通過檢測外周血中表達腫瘤相關標記物的mRNA(CEA mRNA,CK19 mRNA,LUNX mRNA等)碎片，通過反轉錄的方式轉變為cDNA，再利用PCR技術擴增后檢測、分析CTCs[9]。

CellSearchTM系統目前在肺癌CTCs檢測中得到廣泛的認可和應用。該系統主要由自動化的免疫磁性分離系統和免疫熒光分析系統組成。檢測標本首先通過陽性和陰性免疫磁珠，分離出EpCAM+CK+的細胞，去除CD45+的白細胞。再通過包含有備選檢測圖像的圖庫，對分離的細胞進行全自動的熒光分析，最終篩選出直徑大、細胞變形、細胞核變異、染色異常的CK+EpCAM+CD45-細胞為CTCs[10]。該系統具有高效、快捷、操作簡便、靈敏度及特異度高的特點。但該系統也存在部分不表達腫瘤特異性抗原的CTCs無法被檢出的缺陷。

CTCs-chip通過7 800個結合抗EpCAM抗體的微陣列組成微流體平臺，嚴格控制血液流過芯片的速度和剪切力，每1個位點能夠直接捕獲CK+、EpCAM+、DAPI+的CTCs，而CD45+的血細胞則被消除。在肺癌、乳腺癌、腸癌、前列腺癌、胰腺癌中可達到99.1%的靈敏度和100.0%的特異度[11]。該方法僅需一步操作，不需要復雜的前期準備，能夠最大化地避免CTCs的丟失、破壞及標本的污染。同時，該方法還能檢測出既往檢測方法沒有發現過的罕見CTCs細胞群。

2 CTCs在早期肺癌診斷中的預測價值

在肺癌早期階段，CTCs的存在并不直接意味遠處轉移的存在。只有極少的CTCs能夠與血管內皮建立聯系，通過上皮間質轉化的形式侵入遠處薄壁組織，形成轉移瘤[12]。TANAKA等[13]研究發現，30.6%的早期肺癌患者能檢測到CTCs。而分期越晚，CTCs檢出率越高。KURUSU等[14]研究顯示在ⅡA、ⅡB、ⅢA期肺癌患者中CTCs檢出率為50%、73%、100%，高于ⅠA、ⅠB期的36%、41%。

3 CTCs在肺癌手術中的預測價值

SAWABATA等[15]發現術后每7.5 mL血液中CTCs≥5個有更短的腫瘤復發時間。YAMASHITA等[16]發現術后CTCs的數量與總生存率相關。提示CTCs可做為檢測術中腫瘤播散、預測術后復發的有效指標。對術后CTCs高于分界點的患者，即使為ⅠA或ⅠB期，術后輔助化療是否盡早使用仍值得進一步研究。

4 CTCs在進展期肺癌診斷中的價值

KATSEL等[17]研究發現，CK19陽性的CTCs與淋巴結、骨、腎上腺、腦轉移相關；PTHrP陽性的CTCs與骨轉移相關；LUNX陽性的CTCs與淋巴結轉移相關。Ⅳ期肺癌患者的CTCs檢出率明顯增高。MUINELO等[18]研究顯示，CTCs是影響進展期NSCLC患者化療后無瘤生存率及總體生存率的獨立預后因素。雖然多數研究都支持CTCs可作為進展期肺癌診斷、評價療效及預后的指標，但仍存在檢出率差異大，結果對立等問題。這可能與檢測方法及治療模式不統一，療效評價標準不一致、敏感性不足、樣本量偏小等因素有關。仍需高靈敏度的檢測系統的發展、統一，開展多中心、大樣本量的研究來解決。

5 CTCs在進展期肺癌化療應用的價值

NAGRATH等[19]研究發現，每一周期化療后CTCs檢出值的變化與腫瘤體積的變化一致，CTCs檢出率越低的患者，療效越好。但NAIR等[20]研究發現，CTCs的變化與化療后腫瘤體積的變化沒有相關性。這些研究結果的不一致性，可能與腫瘤的異質性、化療方案的差異、耐藥基因的表達不同等因素有關，值得我們進一步的探索和研究。

6 CTCs在肺癌放療應用的價值

CHEN等[21]研究顯示，接受同期放化療后，未檢出CTCs的肺癌患者其療效及預后明顯優于檢出CTCs的患者。但GE等[22]研究顯示，根治性放療后的肺癌患者，雖然CTCs檢出值有明顯的降低，但與療效沒有相關性。

7 CTCs在肺癌分子靶向治療應用的價值

CTCs由于具有原發腫瘤同源的基因及遺傳特性，因此能微創、動態、實時的檢測肺癌驅動基因，在臨床上已開始得到廣泛關注和應用。

當前研究顯示，通過CTCs檢測表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)突變與組織檢測EGFR突變具有高度的一致性，同時通過CTCs檢測T790M的突變能夠預測耐藥性的發生。MAHESWARAN等[23]通過CTCs檢測并經組織證實具有EGFR突變的患者，其一致性達95%；而在64%耐藥后的患者中，有33%檢測到T790M的突變。SUNDARESAN等[24]研究發現，組織中與CTCs中T790M突變檢出率分別為75%和70%。PAILLER等[25]分別檢測組織與CTCs中的間變淋巴瘤激酶(ALK)重排發現，檢出ALK重排一致性100%。

目前通過CTCs檢測肺癌患者的驅動基因仍存在特異度高而靈敏度低的缺點。對CTCs檢測基因陰性的患者仍需組織基因檢測進一步證實。因此，提高檢測技術的靈敏度仍是CTCs能否在基因檢測領域得到進一步推廣和應用的關鍵所在。

8 CTCs的發展展望

近幾年來，CTCs在整個腫瘤醫學領域獲得了極大的關注。首先，CTCs具有安全、方便、實時、可重復等優點，在肺癌的篩查、診斷、治療、預后等方面具有較好的應用前景。其次，通過CTCs檢測驅動基因的突變，可作為靶向藥物選擇的依據。再次，通過研究CTCs的分子和基因特征，能夠深入了解肺癌的生物學特性及轉移機制。

但目前存在的許多問題仍限制CTCs在臨床中廣泛應用，主要包括(1)由于肺癌缺乏特異度的腫瘤標志物，而循環系統中CTCs數量稀少，現有的檢測技術均存在特異度高，而靈敏度不足的缺點;(2)當前與CTCs相關的臨床研究，由于在試驗設計、方法、對象、標準、質控等方面的不同，其結果存在較大的差異性和矛盾性。缺乏多中心、大樣本量的試驗研究來建立統一的標準和共識;(3)當前CTCs檢測費用昂貴，無法作為臨床常規檢測項目進一步推廣。

目前CTCs仍無法取代組織病理在肺癌中“金標準”的地位，但隨著檢測技術的不斷更新和發展，其在肺癌研究、預防、診斷、治療領域的優勢將會突顯，從而得到推廣和應用。

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