電針刺激百會穴、夾脊穴對脊髓損傷大鼠神經(jīng)病理性疼痛的改善作用觀察

朱瑞婷，張磊，孟召實 ，江俊杰，張軍 ，劉忠良，張海娜

1吉林大學(xué)護(hù)理學(xué)院，長春130000； 2 吉林大學(xué)第二醫(yī)院

神經(jīng)病理性疼痛(Neuropethic pain,NPP)是指周圍或中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性或繼發(fā)性損害或功能障礙引起的疼痛。NPP患者常出現(xiàn)自發(fā)性疼痛、感覺遲鈍、感覺異常及痛覺過敏等癥狀，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。NPP是脊髓損傷后的常見并發(fā)癥之一，脊髓損傷后NPP所占比例高達(dá)30%。脊髓損傷后NPP的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。臨床上多采用三環(huán)類抗抑郁藥、5-羥色胺-去甲腎上腺素再攝取抑制劑和加巴噴丁等藥物進(jìn)行治療，可一定程度上緩解患者疼痛，但藥物不良反應(yīng)大，患者耐受性低，且需長期用藥，停藥后復(fù)發(fā)率高，因此整體治療效果欠佳[1]。電針隸屬中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，通過辨證施治能夠舒經(jīng)活絡(luò)，改善循環(huán)，止痛鎮(zhèn)痛[2]。目前臨床亦有利用電針治療脊髓損傷后NPP的報道，但多探討其臨床療效，針灸改善NPP的機(jī)制尚不明確。2019年～2020年7月，我們觀察了電針刺激百會穴、夾脊穴對脊髓損傷大鼠神經(jīng)病理性疼痛的改善作用，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 雄性SPF級Wistar大鼠45只，體質(zhì)量220～250 g，由吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心提供。所有動物研究均通過吉林大學(xué)第二醫(yī)院動物實驗中心倫理審查委員會審查通過。飼養(yǎng)期間大鼠自由飲食飲水，保證定時通風(fēng)光照，室溫22～25 ℃。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行正式實驗。白細(xì)胞介素1(IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的ELISA試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，華佗牌針灸針購自蘇州醫(yī)療用品有限公司，C6805-Ⅰ型電針治療儀購自常州電子醫(yī)療器械有限公司，Von Frey 纖維絲測痛儀購自安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司。

1.2 動物分組及模型制備 將45只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為電針組、模型組及對照組，每組15只。除對照組正常飼養(yǎng)外，電針組、模型組均制備脊髓損傷模型。于腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)，充分麻醉后，將大鼠俯臥位固定在手術(shù)板上，觸摸大鼠背部髂嵴最高點平對S6節(jié)段，向上摸至T12～S1節(jié)段，以此定位，以T12為中心進(jìn)行消毒。使用碘伏消毒后切開背部皮膚逐層撥開筋膜及棘間肌，逐漸暴露T11～S2節(jié)段椎板，小心咬開T11～S1椎板，并將T12兩側(cè)椎弓根完全咬斷，暴露出清晰可見的由硬脊膜包被的脊髓。應(yīng)用自制的打擊器使用5 g×10 cm通過垂直下落的金屬桿打擊硬脊膜，制作脊髓挫傷模型，可見大鼠尾巴抽搐后松軟無力，硬脊膜紅腫。造模后結(jié)束后，分層縫合肌肉和皮膚。術(shù)后使用青霉素腹腔注射，預(yù)防感染，減少死亡率。

1.3 大鼠百會穴、夾脊穴電針刺激方法 電針組造模后第7 天時對百會穴、脊柱兩側(cè)夾脊穴行電針治療。百會穴位于頭頂正中線與兩耳尖連線的交叉處。夾脊穴位于脊髓損傷處上下約2個脊髓段(T10～11和S1～2)的椎體旁側(cè)之間。治療時每個穴位各刺入1枚毫針，進(jìn)針深度為穿皮后再進(jìn)針約2 mm，刺激強(qiáng)度為12～15 mV，刺激頻率為2 Hz，波形選擇為疏密波，留針時間為30 min，1次/天，共治療7 d。模型組和對照組不予以針灸治療。

1.4 百會穴、夾脊穴電針刺激前后大鼠的PWPT測定 造模后第3、7、14天分別將電針組大鼠放于配有測量儀的有機(jī)玻璃盒內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境15 min后，啟用Von-Frey纖維絲刺激大鼠左右后肢足底，記錄大鼠足收縮時的PWPT。大鼠出現(xiàn)抬足或舔足動作視為陽性反應(yīng)，否則記錄為陰性反應(yīng)。每次測定間隔5 min，模型組和對照組于同時段測定PWPT。

1.5 百會穴、夾脊穴電針刺激前后大鼠脊髓組織學(xué)檢查 造模后第14天取電針組大鼠脊髓，模型組和對照組于同時段取大鼠脊髓，觀察脊髓組織形態(tài)。大鼠先用10%的水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔麻醉，然后再用4%的多聚甲醛心內(nèi)灌注固定，以打擊點為中心取5 mm的脊髓節(jié)段，放在同一固定液中保存。常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片厚5 μm，取各組大鼠的脊髓組織標(biāo)本，行常規(guī)蘇木精-伊紅染色。經(jīng)包埋、切片、脫蠟、水化、染色等步驟后在光學(xué)顯微鏡下觀察脊髓損傷前后、針灸治療前后脊髓組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.6 百會穴、夾脊穴電針刺激前后大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α檢測 造模后第3、7、14天時取電針組大鼠，模型組和對照組于同時段取大鼠，置于特定容器中暴露鼠尾，于鼠尾靜脈抽取靜脈血，離心后留取上清。ELISA法檢測大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 不同時間點各組大鼠PWPT比較 不同時間點各組大鼠PWPT比較見表1。

表1 不同時間點各組大鼠PWPT比較

2.2 各組大鼠脊髓組織病理學(xué)變化 對照組脊髓的細(xì)胞形態(tài)學(xué)正常、組織結(jié)構(gòu)完整；模型組可見脊髓組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，可見脊髓空洞，神經(jīng)元及尼氏體顯著減少，細(xì)胞呈空泡樣狀，伴隨細(xì)胞核的固縮；電針組可見脊髓組織的損傷程度減輕，神經(jīng)元及尼氏體較前增多。

2.3 不同時間點各組大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平比較 不同時間點各組大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平比較見表2。

表2 不同時間點各組大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平比較

3 討論

脊髓損傷是一種長期的致殘性損傷[3]。NPP是脊髓損傷后的一種衰弱性的結(jié)果，它的機(jī)制仍然不清楚。近年來許多研究表明神經(jīng)損傷后，脊髓中的膠質(zhì)細(xì)胞被激活，釋放炎性介質(zhì)如IL-1、 IL-6、TNF-α等并刺激疼痛信號分子，如谷氨酸、P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽的產(chǎn)生，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞促炎介質(zhì)的長時間釋放可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)改變，導(dǎo)致神經(jīng)性疼痛[4,5]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠經(jīng)過脊髓垂直打擊后，相對對照組血清中的IL-1、IL-6和TNF-α明顯升高，該結(jié)果與既往研究一致，表明脊髓損傷可誘發(fā)炎性介質(zhì)的釋放繼而誘發(fā)NPP。

目前NPP在臨床上的治療，除外一些常規(guī)藥物外尚沒有較好的根治方法。在藥物難治性病例中，可以采用介入療法、物理療法和心理療法[6]。針灸治療脊髓損傷后引發(fā)的NPP可能是一種新的思路。中醫(yī)理論認(rèn)為，脊髓損傷后NPP的病機(jī)為督脈損傷，腎陽虛衰，瘀血阻滯。督脈循脊髓而行，外傷傷及脊髓，督脈首當(dāng)其沖，經(jīng)脈不通，血行受阻，督脈損傷，失卻溫煦，則寒凝血瘀[7]。百會在頭部，屬督脈，針刺可疏通受損督脈，百會亦能調(diào)理腦神，腦神安則疼痛消[8]。夾脊穴亦歸屬于督脈，是重要的經(jīng)外奇穴[9]。張樹卿等[10]采取針刺法治療脊髓疾病繼發(fā)NPP患者，A組行頭針叢刺長留針治療，B組行夾脊電針治療，C組行A+B聯(lián)合治療。治療1、3月后患者的VAS評分明顯降低，以C組更為明顯。王希文等[11]采取同樣方法治療患者后，發(fā)現(xiàn)患者的McGill評分明顯降低，以C組更為明顯。夾脊電針療法能改善患者病變局部的血供情況，促進(jìn)組織細(xì)胞代謝、氣血循環(huán)及組織營養(yǎng)的改善，且可對部分傳導(dǎo)疼痛的神經(jīng)通路與神經(jīng)中樞發(fā)揮抑制效果，進(jìn)而發(fā)揮較好的止痛效果[12]。針刺百會穴及肌筋膜觸發(fā)點治療脊髓損傷后中樞性疼痛，可有效減輕患者疼痛情況[13]。在本研究中通過測定大鼠機(jī)械性觸痛閾值，發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后大鼠的機(jī)械性觸痛閾值明顯降低，予以電針百會穴和夾脊穴第7天后痛閾明顯提高，結(jié)果證實針刺夾脊穴和百會穴能減輕脊髓損傷后大鼠的機(jī)械性觸誘發(fā)痛行為，可能減輕NPP。

雖然針灸治療脊髓損傷后NPP有較好臨床療效，但是針灸治療脊髓損傷后NPP的機(jī)制尚未明了。針刺治療疼痛的可能機(jī)制有節(jié)段性抑制途徑、釋放內(nèi)源性阿片樣物質(zhì)、調(diào)節(jié)腎上腺素能系統(tǒng)、調(diào)節(jié)5-羥色胺信號傳導(dǎo)系統(tǒng)、NMDA/AMPA/KA途徑以及局部炎癥環(huán)境等六種途徑[14]。 針灸的局部作用涉及降低P物質(zhì)、IL- 1β、IL-8、IL-10和TNF- α等炎癥介質(zhì)的水平。與正常肌肉組織相比，病變區(qū)的P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、緩激肽(BK)、5-HT、去甲腎上腺素、TNF-α 和IL-1水平顯著升高[15,16]。這些化學(xué)物質(zhì)使肌肉傷害感受器敏感并激活，將沖動傳遞到大腦，招募脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞在微環(huán)境中發(fā)生炎癥反應(yīng)[17,18]。炎癥過程引起神經(jīng)的過度興奮和痛覺放大，導(dǎo)致慢性神經(jīng)性疼痛，而針灸可以降低炎癥物質(zhì)水平從而有效改善臨床癥狀。

本研究觀察了針刺治療前后脊髓損傷大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α等炎性介質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)針灸治療后血清中IL-1、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平比治療前明顯降低。結(jié)果表明針灸治療NPP的機(jī)制可能與抑制IL-1、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)。IL-1、IL-6和TNF-α是常見的促炎性細(xì)胞因子。有研究[19]顯示，敲除小鼠體內(nèi)的 IL-1β，可降低小鼠的機(jī)械痛敏感性，但是在神經(jīng)損傷部位注射外源性IL-1β后，小鼠的機(jī)械疼痛閾值明顯升高。IL-6基因敲除小鼠的神經(jīng)損傷后的機(jī)械性異常性疼痛明顯少于對照組小鼠[20]，而予以抗IL-6抗體可明顯減輕嚙齒動物的疼痛程度[21]。TNF-α抑制劑，包括英夫利昔單抗、阿達(dá)木單抗、戈利木單抗等，目前已獲得FDA批準(zhǔn)用于治療疼痛性疾病，例如炎性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎[22]。敲除IL-1β、IL-6和TNF-α基因，降低IL-1β、IL-6和TNF-α含量，或者予以IL-1β、IL-6和TNF-α拮抗劑，可明顯降低嚙齒類動物機(jī)械性疼痛閾值，改善神經(jīng)性病理性疼痛。有研究[23]表明,IL-1β、IL-6和TNF-α可能在增強(qiáng)興奮性電流、抑制抑制性電流、促進(jìn) NMDA 釋放興奮遞質(zhì)谷氨酸等不同環(huán)節(jié)改善NPP，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，電針刺激百會穴、夾脊穴，可減輕脊髓損傷大鼠痛敏反應(yīng)，改善鏡下脊髓組織損傷程度，尾靜脈血清IL-1、IL-6、TNF-α水平降低。電針刺激電針刺激百會穴、夾脊穴治療NPP的機(jī)制可能為降低血清IL-1、IL-6及TNF-α水平。