高黏液型肺炎克雷伯菌耐藥性和感染患者臨床特征研究

吳 旻，丁潔霞，鄒 菁，蔣小仙，金 潔，王淑穎，岑盼盼，陳 瓊

(浙江大學醫學院附屬杭州市第一人民醫院 1.感染科；2.院感科；3.細菌室，浙江 杭州 310006)

高黏液型肺炎克雷伯菌(hypermucoviscousKlebsiellapneumoniae， HMKP)是經典肺炎克雷伯菌(classicalKlebsiellapneumoniae， cKP)的一個變種，具有較厚的莢膜和脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)，能保護細菌免受血清因子和吞噬作用的影響[1]。HMKP可導致膿毒血癥、膿腫、腦膜炎、眼炎和重癥肺炎等，致死率高[2-3]。因此，HMKP也被稱為高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，hvKP)。2013年，北京佑安醫院報道了多重耐藥hvKP[4]；2015年，Zhang等[5]首次報道了碳青霉烯類耐藥HMKP(carbapenem resistant HMKP，CR-HMKP)菌株；之后浙江[6]、四川[7]、安徽[8]、香港[9]等多地出現了CR-HMKP流行。本研究對HMKP菌株耐藥性和感染患者的臨床特征進行分析，以期為臨床控制HMKP流行提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 菌株來源和鑒定 收集2017年1月—12月于浙江大學醫學院附屬杭州市第一人民醫院臨床分離的65株HMKP菌株，來自41例患者，所有菌株拉絲試驗均為陽性[10]。65株HMKP菌株采集自血液18株(27.7%)，膽汁19株(29.2%)，膿液7株(10.8%)，痰液7株(10.8%)，動靜脈導管液3株(4.6%)，潔尿3株(4.6%)，關節液、胸水、腹水和腦脊液共8株(12.3%)。13例感染患者在≥2個不同部位培養到HMKP菌株。10例CR-HMKP感染患者中有3例來自消化科，2例來自ICU，2例來自肝膽外科，胃腸外科、腦外科、腎內科各1例。選取來自不重復患者的不重復HMKP菌株41株作為研究菌株，利用基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(MALDI-TOF/MS)進行菌種鑒定。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.2 藥物敏感試驗和產廣譜β內酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)表型測定 藥物敏感試驗和ESBLs表型測定采用Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(Marcy-l étoile， France)。藥敏結果根據2017年美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)標準判定，對亞胺培南或厄他培南耐藥的菌株判定為CR-HMKP，對亞胺培南和厄他培南均敏感的菌株判定為碳青霉烯類敏感HMKP(carbapenem susceptible HMKP，CS-HMKP)。

1.3 CR-HMKP菌株多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)和莢膜血清學分型(K分型) 按照巴斯德研究所MLST網站(http://bigsdb.Pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)描述，對7個管家基因進行MLST分析：孵育和收集4 mL CR-HMKP菌液，提取菌株的DNA。以7個管家基因 (gapA、infB、rpoB、phoE、mdh、pgi、tonB) DNA為模板，配制25 μL反應體系，PCR擴增目的基因。PCR反應條件：預變性94 ℃ 2 min，循環94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環；最后延伸 72 ℃ 5 min。PCR產物經純化及雙向測序， 將7個管家基因的序列與MLST數據庫中已知的等位基因序列比對，獲得相應序列號。采用PCR對CR-HMKP菌株進行莢膜血清學分型，包括K1、K2、K5、K16、K20、K54、K57[4]。

1.4 HMKP菌株毒力因子檢測和CR-HMKP菌株碳青霉烯酶基因檢測 參考相關文獻[11-13]，對41株不重復的HMKP 菌株進行10個毒力因子基因檢測，包括莢膜(rmpA，magA)、LPS (uge，wabG)、菌毛(fimH)、含鐵細胞(iutA，iroN，entB)和其他毒力基因(allS，kfu)[11-12]。對CR-HMKP菌株的碳青霉烯酶基因(blaKPC-2，blaVIM，blaIMP，blaOXA-48，blaNDM-1)[13]進行檢測：孵育和收集4 mL HMKP菌液，提取菌株的DNA；PCR擴增上述目的基因[11-13]。DNA測序，采用Bioedit軟件進行序列比對。

1.5 患者臨床特征分析 對患者的臨床資料進行回顧性分析，包括患者一般資料、感染狀況、治療結局等。

1.6 統計學分析 采用SPSS 13.0軟件，計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 菌株耐藥性情況 41株HMKP菌株中有31株CS-HMKP和10株CR-HMKP。3株CS-HMKP菌株檢測到ESBLs。CS-HMKP和CR-HMKP菌株抗生素藥物敏感性分布見表1。CS-HMKP菌株對除阿莫西林克拉維酸、頭孢菌素和氨曲南外的其他測定抗生素敏感，10株CR-HMKP均對替加環素敏感，對其他測定抗生素表現為高度耐藥。

表1 HMKP菌株抗生素敏感性分布情況 (mg/L)

2.2 CR-HMKP菌株分子生物學分析結果 10株CR-HMKP均為ST11，莢膜血清型K57型3株，K2型1株，6株未成功分型。40株HMKP分離株中檢測到rmpA基因， 39株HMKP中檢測到uge基因，34株HMKP中檢測到allS基因，36株HMKP中檢測到kfu基因。iutA、entB、iroN、fimH和wabG在41株HMKP中均檢測到。CS-HMKP菌株與CR-HMKP菌株的毒力基因譜分布相似。10株CR-HMKP菌株均產KPC-2碳青霉烯酶，未檢測到其他碳青霉烯酶(VIM， IMP， OXA-48和NDM-1)。

2.3 感染患者臨床特征分析 20例(48.8%)感染患者發生遷徙性膿腫，以肝膿腫發生率最高，且主要來自CS-HMKP感染。CR-HMKP感染患者的多部位感染發生率，肺部感染率，尿路感染率及關節液、胸水、腹水和腦脊液的感染率均高于CS-HMKP感染患者，差異均有統計學意義(P<0.05)。16例(39.0%)HMKP感染患者有合并復數菌感染，主要為腸球菌。CR-HMKP感染患者合并復數菌感染率高于CS-HMKP感染患者，差異有統計學意義(P<0.05)。CR-HMKP感染患者的30天手術外傷史比例、90天內住院史比例、呼吸系統疾病比例均高于CS-HMKP感染患者，差異均有統計學意義(P<0.05)。留置導管方面，深靜脈置管、導尿管留置和胃腸道置管的CR-HMKP感染患者的比例高于CS-HMKP感染患者，差異均有統計學意義(P<0.05)。CR-HMKP感染患者白細胞計數高于CS-HMKP感染患者，血清白蛋白水平低于CS-HMKP感染患者，凝血酶原時間和住院天數長于CS-HMKP感染患者，SOFA評分、死亡率和醫療費用高于CS-HMKP感染患者，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 HMKP感染患者臨床特征分析

3 討論

本研究從宿主、病原體和宿主—病原體相互關系對HMKP菌株耐藥性、毒力因子分布和感染患者臨床特征進行系統研究。本研究分離的CS-HMKP菌株對抗生素保持較高的敏感性，7.3%(3/41)的HMKP菌株產ESBLs，4.9%(2/41)的HMKP菌株表現為多重耐藥，低于文獻[14]報道的16.3% hvKp產ESBLs和20.0%多重耐藥表現。近幾年，CR-HMKP頻繁地從中國患者中分離[5-9]，且同一株HMKP上常攜帶多種耐藥基因，可能與HMKP對亞裔人種的高感染力和碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌(carbapenem resistantKlebsiellapneumoniae， CRKP)菌株在我國流行傳播有一定關系。研究[15]表明，K1和K2莢膜血清型是HMKP主要的莢膜血清型。本研究分離的CR-HMKP菌株莢膜血清型主要以K57型(30%)為主，這是鮮有報道的[16]。質粒介導的碳青霉烯酶是目前造成肺炎克雷伯菌乃至高毒力肺炎克雷伯菌產生碳青霉烯類抗生素耐藥的重要原因[17]。本研究中的CR-HMKP菌株均為含有blaKPC-2基因的ST11型，未檢測到其他碳青霉烯酶。研究[18]發現，ST11是產碳青霉烯酶KPC酶的主要克隆型，但在HMKP菌株中很少被報道。自2015年以來，浙江多家醫院發生ST11型CR-HMKP菌株的暴發流行[11，19]。有研究[20]發現，CR-hvKP 菌株可同時攜帶毒力質粒和耐藥質粒，甚至耐藥基因和毒力基因可通過同一質粒“共傳播”。還有研究[21]發現， ST11型肺炎克雷伯菌株存在外膜蛋白OmpK36缺失，這可能是造成菌株高耐藥、高毒力和高致病力的原因[22]。CR-HMKP合并ST11在全球范圍內的流行應引起關注。

本研究中的10例CR-HMKP感染患者中有8例(80%)發生了多部位侵襲感染，6例(60%)最終死亡，其中1位尿毒癥患者和1位腦外傷原發肺部感染患者均在5處不同的標本中培養到CR-HMKP，提示CR-HMKP的傳播力和致死率較高。41例HMKP感染的研究病例中，20例(48.8%)出現遷徙性膿腫，其中17例為CS-HMKP感染。12例(29.3%)HMKP感染患者表現為肝膿腫，高于研究[14]報道的hvKP可致10.0%的肝膿腫發生率。本研究還發現3例CS-HMKP感染的社區獲得肛周膿腫。

臨床特征比較分析表明，有以下情況的患者更易發生CR-HMKP感染： 90天內有住院病史、30天內有手術外傷史、深靜脈留置、留置導尿管、胃腸道置管以及低下的營養狀態(血清白蛋白水平低下)。CR-HMKP感染也更易出現肺部感染、尿路感染和多部位感染，同時易合并復數菌感染，表現出更明顯的白細胞水平上升，SOFA評分提高，凝血酶原時間延長，更高的死亡率和高額醫療費用的支出。這與普遍認同的CRKP感染危險因素一致。