中華蜜蜂PLA2基因的生物信息學(xué)分析及響應(yīng)高溫脅迫的表達(dá)模式

李新宇，馬衛(wèi)華，李立新，申晉山，杜亞麗，龍登隆， 張 琪，劉晉佳，王春梅，蘭 俊，馮宇佳，姜玉鎖*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所)，山西太原 030800)

磷脂酶A2 (PLA2)于動(dòng)物各組織的細(xì)胞膜及線粒體膜上廣泛分布，其作用底物主要是磷脂，可將其分解為溶血磷脂和脂肪酸(Owenetal., 1990; Kelleyetal., 1992)。磷脂是細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜的重要組成部分，因此，PLA2能對(duì)細(xì)胞膜的流動(dòng)性、膜蛋白活性等細(xì)胞生理功能產(chǎn)生重要的影響，同時(shí)水解磷脂會(huì)產(chǎn)生脂肪酸，它是許多重要代謝途徑的參與者(Keijietal., 2000; Macphee, 2001)。因此，PLA2對(duì)于脂類代謝調(diào)節(jié)以及生物膜功能有重要意義。根據(jù)作用部位、鈣離子依賴性，可將PLA2分為4類：分泌型、胞質(zhì)型、不依賴Ca2+型和 PAF (血小板激活因子) -PLA2(陳莉延等，2000；林芳等，2001)。近些年來(lái)，已有人對(duì)蜜蜂PLA2的基因結(jié)構(gòu)、酶活性，蛋白晶體結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行了一系列研究。Scott等人(1990)首先應(yīng)用X衍射方法獲得了意大利蜜蜂PLA2的晶體結(jié)構(gòu)，確定了意大利蜜蜂PLA2的5個(gè)二硫鍵位置、Ca2+結(jié)合位點(diǎn)和酶活性中心等。隨后Li等人(2005)對(duì)意大利蜜蜂PLA2基因進(jìn)行了研究，克隆了該基因，結(jié)果顯示其核苷酸序列全長(zhǎng)405 bp，編碼134個(gè)氨基酸殘基，分子量為14.7 kDa，并包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。而沈立榮等(2002, 2004)又對(duì)PLA2的生物活性進(jìn)行了探究，Western blot分析結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物與天然PLA2具有相同的生物學(xué)活性。

細(xì)胞膜的動(dòng)力學(xué)特性對(duì)于生物體是至關(guān)重要的，細(xì)胞膜的完整性保證了神經(jīng)系統(tǒng)能正常發(fā)揮其功能(Sens and Plastino, 2015; Repasky and Black, 2015)。溫度的升高，使得細(xì)胞膜內(nèi)的飽和脂肪酸比例升高，不飽和脂肪酸比例下降，這導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性下降，細(xì)胞的相關(guān)生理功能受到影響(Rensing and Ruoff, 2002；Mark Rütgersetal., 2017)。研究發(fā)現(xiàn)在高溫作用下，昆蟲體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生熱激蛋白抵御高溫壓力(Garridoetal., 2012)，而一些熱休克蛋白則能夠激活PLA2，導(dǎo)致細(xì)胞膜PLA2活性增加，促進(jìn)水解反應(yīng)，擾亂細(xì)胞膜代謝和神經(jīng)信號(hào)傳遞，使得蟲體遭受損傷(Mahalkaetal., 2011)。因此，高溫引起蜜蜂脂質(zhì)和脂肪酸的代謝紊亂，進(jìn)而影響細(xì)胞膜代謝和神經(jīng)信號(hào)傳遞，這可能是蜜蜂高溫下死亡的重要原(Cogginsetal., 2011)。這說(shuō)明高溫下PLA2的表達(dá)增加是機(jī)體對(duì)高溫脅迫響應(yīng)的重要標(biāo)志。

中華蜜蜂Apisceranacerana作為我國(guó)本土蜂種，在維持我國(guó)生態(tài)環(huán)境平衡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用(Zhangetal., 2014)，與引入品種西方蜜蜂相比，具有嗅覺靈敏、善于采集零星蜜源、抗逆性和抗螨能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)(曾志將等，2002；楊冠煌等，2005)。對(duì)中華蜜蜂PLA2基因進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，并測(cè)定其在不同溫度及高溫不同脅迫時(shí)間下的表達(dá)模式，以期揭示PLA2在中華蜜蜂應(yīng)對(duì)高溫脅迫時(shí)的生理功能，同時(shí)為蜜蜂耐熱性的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

樣品采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)飼養(yǎng)的中華蜜蜂。試驗(yàn)蜂群選取條件：群勢(shì)較強(qiáng)、健康無(wú)病、無(wú)自然分蜂趨勢(shì)，共3群。每群各選取1～2張老熟的封蓋子脾，在34℃和RH 75%的條件下孵育。待幼蜂出房后，用標(biāo)記顏料(無(wú)毒、無(wú)味)在幼蜂背部標(biāo)記，分兩次標(biāo)記，每次每群標(biāo)記500頭，之后將這些標(biāo)記的幼蜂放回原來(lái)的蜂群，在第20天時(shí)進(jìn)行采樣。

高溫處理時(shí)，將蜜蜂放置在扎有小孔的15 mL離心管中，每管放置1頭蜜蜂，迅速將其放入恒溫恒濕箱中，溫濕度設(shè)置為：RH 30%，溫度分別為25℃、30℃、35℃、40℃和45℃。2 h后立即將每組隨機(jī)選擇的30頭蜜蜂迅速投入液氮中，隨后于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｔ诟邷?5℃，RH 30%條件下分別處理0.5 h、1 h、1.5 h和2 h，其中，0 h處理的蜜蜂直接采自蜂箱中，處理后，立即將每組隨機(jī)選擇的30頭蜜蜂迅速投入液氮中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

Trizol試劑盒(Ambion)，PrimeScriptTM RT-PCR reagent Kit試劑盒(TaKaRa)，SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa)；氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇等常規(guī)試劑均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

AB-9902型觸摸式PCR儀(AB)，7500FAST型熒光定量PCR儀(ABI)，ND-1000核酸蛋白測(cè)定儀，(Nanodrop)Universal HoodⅡ核酸蛋白成像儀(BIO-RAD)，5810R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)。

1.3 提取RNA和cDNA第一鏈的合成

樣品液氮研磨后，使用Trizol試劑盒提取各樣品總RNA，在1.5%瓊脂糖凝膠上監(jiān)測(cè)每種樣品的RNA降解和污染情況。使用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定提取RNA的濃度。再根據(jù)PrimeScriptTM RT-PCR reagent Kit試劑盒，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板。

1.4 引物設(shè)計(jì)

以東方蜜蜂全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過Blast比對(duì)篩選出中華蜜蜂PLA2基因，根據(jù)所得序列的CDS區(qū)使用Primer 3軟件設(shè)計(jì)RT-qPCR引物。β-actin用作內(nèi)標(biāo)，引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)公司合成。

表1 RT-qPCR引物序列

1.5 熒光定量PCR反應(yīng)

將反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA模板稀釋5倍后，使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系總體積為20 μL，含cDNA模板2 μL，SYBR Premix Ex TaqTMII (2×) 10 μL，ROX Reference Dye II (50×) 0.4 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH2O 6 μL。qRT-PCR熱循環(huán)程序如下：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火及延伸34 s，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)組織樣本重復(fù)測(cè)定3次。

1.6 序列分析

利用各類生物信息學(xué)軟件對(duì)中華蜜蜂PLA2的序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，所用各軟件如表2。

表2 生物信息學(xué)分析所用軟件

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

熒光定量PCR中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及熒光曲線的Ct值，采用2- ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。運(yùn)用SPSS 21.0軟件中的Kruskal-Wallis H進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華蜜蜂PLA2編碼蛋白分析

對(duì)中華蜜蜂PLA2基因序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，PLA2開放閱讀框(ORF)全長(zhǎng)745 bp，編碼169個(gè)氨基酸，分子量為19.3 kDa包含20種常見氨基酸，其中Gly和Leu含量最高(8.9%)，Gln含量最低(1.8%)，等電點(diǎn)為7.01，脂溶指數(shù)為64.02，平均親水力為-0.502，不穩(wěn)定系數(shù)為23.67，說(shuō)明中華蜜蜂PLA2蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

2.2 中華蜜蜂PLA2的信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、糖基化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

中華蜜蜂PLA2信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其1～20位氨基酸的S值均大于閾值0.5，表明其信號(hào)肽區(qū)域?yàn)榈?～20位氨基酸的片段(圖1)。中華蜜蜂PLA2各氨基酸的預(yù)測(cè)值均大于閾值1，表明中華蜜蜂PLA2無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，其不屬于膜蛋白(圖2)。中華蜜蜂PLA2蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該蛋白Thr62的O糖基潛力值為0.517，高于閾值0.5，說(shuō)明中華蜜蜂PLA2存在O糖基化位點(diǎn)，但未預(yù)測(cè)到帶相應(yīng)的N糖基化位點(diǎn)(圖3)。中華蜜蜂PLA2蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明：中華蜜蜂PLA2存在磷酸化位點(diǎn)，且出現(xiàn)在絲氨酸Ser、蘇氨酸Thr以及酪氨酸Tyr這3種氨基酸殘基上。其共包含13個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包括Ser7、Ser16、Thr17、Thr41、Ser77、Ser81、Thr86、Ser95、Thr101、Tyr103、Ser115、Tyr151、Thr152(圖4)。

圖1 中華蜜蜂PLA2信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)Fig.1 Predicted signal peptide of AcerPLA2

2.3 中華蜜蜂PLA2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)

中華蜜蜂PLA2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：中華蜜蜂PLA2的二級(jí)結(jié)構(gòu)由螺旋(helices)、股(strand)和環(huán)(loops)3種結(jié)構(gòu)組成，所占比例分別為11.83%、21.89%和66.27%。中華蜜蜂PLA2的三級(jí)結(jié)構(gòu)中主要的結(jié)構(gòu)有螺旋和β折疊(圖5)。

2.4 中華蜜蜂PLA2的進(jìn)化樹分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，中華蜜蜂PLA2序列與蜜蜂科昆蟲的相似性最高。而中華蜜蜂PLA2與其他膜翅目昆蟲的相似性存在差異，表明其具有較高的變異性(圖6)。

圖2 中華蜜蜂PLA2跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)Fig.2 Predicted transmembrane regions of AcerPLA2

圖3 中華蜜蜂PLA2糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)Fig.3 Predicted glycosylation of AcerPLA2

圖4 中華蜜蜂PLA2磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)Fig.4 Predicted phosphorylation sites of AcerPLA2

圖5 中華蜜蜂PLA2二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)Fig.5 Predicted secondary and tertiary structure of AcerPLA2注：A，中華蜜蜂PLA2的二級(jí)結(jié)構(gòu)；B，中華蜜蜂PLA2的三級(jí)結(jié)構(gòu)。Note：A，secondary structure of AcerPLA2; B，tertiary structure of the AcerPLA2.

圖6 不同昆蟲PLA2氨基酸序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of PLA2 from different insect species based on amino acid sequences注：PLA2序列來(lái)源：中華蜜蜂Apis cerana cerana，AF321087.1；西方蜜蜂Apis mellifera，NM 001011614.1；小峰熊蜂Bombus hypocrita，JF751030.1；畢氏卵角蟻Ooceraea biroi，XM 011337410.3；佛羅里達(dá)弓背蟻Camponotus floridanus，XM 025413770.1；小家蟻Monomorium pharaonis，XM 012687703.2；跳鐮猛蟻Harpegnathos saltator，XM 025307483.1；切葉蟻Acromyrmex echinatior，XM 011055015.1；細(xì)偽切葉蟻Pseudomyrmex gracilis，XM 020439241.1

2.5 中華蜜蜂PLA2在不同溫度脅迫下的表達(dá)

中華蜜蜂PLA2在各溫度下的相對(duì)表達(dá)量顯示PLA2mRNA表達(dá)量受高溫影響，其中在35℃、40℃和45℃時(shí)表達(dá)量較高，且在35℃時(shí)表達(dá)量最高(圖7)。

圖7 中華蜜蜂PLA2在不同溫度脅迫時(shí)的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression levels of PLA2 mRNA in response to different temperature treatments注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。下圖同。Note: Data were mean±SE．The same below.

2.6 中華蜜蜂PLA2在不同脅迫時(shí)間下的表達(dá)

中華蜜蜂PLA2在不同脅迫時(shí)間下的相對(duì)表達(dá)量表明(圖8)：較長(zhǎng)時(shí)間的脅迫能導(dǎo)致PLA2 mRNA表達(dá)量的升高，其中在1 h,1.5 h和2 h表達(dá)量較高，且在1 h達(dá)到最高的表達(dá)水平。

圖8 中華蜜蜂 PLA2在不同脅迫時(shí)間下的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression levels of PLA2 mRNA in response to different process time

3 結(jié)論與討論

PLA2在生物界廣泛分布，人們已經(jīng)從多種植物、動(dòng)物、微生物中分離得到。PLA2能影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性以及膜蛋白活性。本研究發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂PLA2無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，不屬于膜蛋白，所以PLA2對(duì)細(xì)胞膜的影響需要其他蛋白參與，它們與PLA2協(xié)同作用。研究發(fā)現(xiàn)Hsp70在有ATP和Mg2+的條件下可以在體外激活PLA2(Calderwoodetal., 1993)。通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂PLA2的序列與蜜蜂科昆蟲的相似性最高，而與其他膜翅目昆蟲相似性存在差異，這可能與昆蟲的生活環(huán)境和習(xí)性有關(guān)。

高溫等環(huán)境壓力能激活PLA2，并提高其活性從而對(duì)細(xì)胞的生理代謝產(chǎn)生影響。因此，PLA2是生物體遭受壓力脅迫的重要標(biāo)志物,其在生物體抗逆過程中的調(diào)控作用一直受到研究者的關(guān)注。許多報(bào)道表明熱刺激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外的大量Ca2+流入細(xì)胞內(nèi)，使得細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度快速增加(Kamanoetal., 2014；Zhangetal., 2016；Dongetal., 2017)。PLA2的N-末端有一鈣離子結(jié)合(CaLB)區(qū)域，是Ca2+作用的部位。細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度是熱休克基因轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵因素，是熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSF)與這些基因啟動(dòng)子中HSE元件結(jié)合所必需的(Jeansetal., 2017；Huangetal., 2018；Isakovic ＇etal., 2019)。Ca2+在熱休克基因中的作用進(jìn)一步表明Ca2+參與熱休克基因的轉(zhuǎn)錄。PLA2和熱休克蛋白都表現(xiàn)出對(duì)Ca2+的高度敏感性，熱休克期間細(xì)胞Ca2+的變化對(duì)于控制具有顯著調(diào)節(jié)活性的熱休克蛋白的翻譯后修飾具有重要的作用(Wenetal., 2015)。同時(shí)，熱休克蛋白能夠通過Ca2+濃度的增加激活PLA2，例如hsp 28通過細(xì)胞Ca2+的增加，激活磷脂酶C的配體(Landryetal., 1992)。本研究結(jié)果表明PLA2基因在不同溫度下的表達(dá)模式存在差異，高溫能提高PLA2的表達(dá)水平，中華蜜蜂PLA2的表達(dá)受高溫脅迫的誘導(dǎo)，PLA2在25℃和30℃處理下表達(dá)量較低，而在35℃、40℃和45℃處理下表達(dá)量較高，這說(shuō)明PLA2能對(duì)高溫脅迫做出快速的響應(yīng)。本研究中高溫下不同脅迫時(shí)間處理結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中華蜜蜂PLA2基因的表達(dá)受脅迫時(shí)間的誘導(dǎo)，PLA2在高溫處理0 h和0.5 h時(shí)表達(dá)量較低，1 h時(shí)達(dá)到最高的表達(dá)水平，較長(zhǎng)時(shí)間的高溫脅迫可以導(dǎo)致PLA2表達(dá)增多。

PLA2的功能除了分解細(xì)胞膜上的卵磷脂外，還調(diào)節(jié)體內(nèi)磷脂類物質(zhì)平衡，PLA2是多種脂類物質(zhì)(花生四烯酸、溶血磷脂酸)產(chǎn)生的限速酶(Yoshidaetal., 2010；Sinderewiczetal., 2017)，由于PLA2可以通過其水解產(chǎn)物影響質(zhì)膜H+轉(zhuǎn)運(yùn)并且改變離子通透性，使得細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平提升，從而對(duì)細(xì)胞相關(guān)生理功能產(chǎn)生影響。相關(guān)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞在遭受一些環(huán)境脅迫后會(huì)發(fā)生非即時(shí)性的死亡。由于PLA2可能令溶酶體膜和線粒體膜不穩(wěn)定，而不利的環(huán)境脅迫常常會(huì)激活PLA2，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞延遲性死亡(Zhengetal., 2016)。高溫誘導(dǎo)PLA2的活化可能是高溫導(dǎo)致機(jī)體損傷的重要原因，該推斷還需要接下來(lái)進(jìn)一步的深入研究。