三種抗生素對西花薊馬存活率及腸道可培養細菌的影響

葉佳琴，郅軍銳，曾 廣，張 濤，黃 宸，周 丹

(貴州大學昆蟲研究所，貴州省山地農業病蟲害重點實驗室，貴陽 550025)

昆蟲體內棲息著大量微生物，包括細菌、古菌、原生生物和真菌等，其中99.00%以上屬于細菌(Egertetal., 2003; 梅承等, 2018)。這些細菌棲居在腸道內并參與宿主的生理反應，與宿主相互依賴，互惠共生(Dale, 2006; Shaoetal., 2017)，某些特殊的細菌在宿主的營養吸收、發育繁殖、抵御病原菌以及抗藥性等方面起著重要作用(Philipp and Moran, 2013)，因此研究昆蟲腸道細菌對于益蟲的保護以及害蟲的綜合治理具有重要的意義。使用抗生素去除腸道細菌是一種行之有效且操作容易的方法，并為進一步驗證腸道細菌的功能奠定了基礎。Lin等(2015)研究發現，利福平和硫酸鏈霉素可不同程度的去除小菜蛾Plutellaxylostella的腸道細菌，導致小菜蛾較高的死亡率；四環素、氨芐青霉素和利福平等可有效去除B型和Q型煙粉虱Bemisiatabaci腸道共生菌Hamiltonella(Ruan, 2010; 蘇奇等, 2012)；利福平、鹽酸土霉素和青霉素G鉀鹽可以有效減少大青葉蟬Cicadellaviridis內共生菌Sulciamuelleri(練啟仙等, 2019)。使用氯霉素、氨芐青霉素和硫酸鏈霉素等抗生素以不同方式飼喂黑豆蚜Aphiscraccivora后可獲得脫共生菌的蚜蟲(苗雪霞, 2004)。

西花薊馬Frankliniellaoccidentalis(Pergande)屬纓翅目Thysanoptera薊馬科Thripidae花薊馬屬Frankliniella，是一種世界性的入侵害蟲(雷仲仁等, 2004; 吳青君等, 2005)。具有個體小，易隱匿，繁殖力強和食性廣等特點，可取食60個科250種作物(Reitzetal., 2019)。西花薊馬可通過直接取食和產卵造成危害，也可間接傳毒危害，對農業生產造成了不可估量的經濟損失(Pappuetal., 2009; Yulinetal., 2012; 謝永輝等, 2013)。西花薊馬已對多種農藥產生了不同程度的抗藥性，使其防治變得更加困難。

De Vries等(2001a)通過顯微鏡觀察、傳統培養和API-20E腸道菌試劑鑒定等方法確定西花薊馬后腸內存在大量的細菌，屬于歐文氏菌屬Erwinia。西花薊馬若蟲通過取食獲得細菌且在2齡時帶菌率為100.00%，在預蛹和蛹期帶菌率有所下降，但成蟲期又明顯升高(De Vriesetal., 2001b)。腸道細菌可以使西花薊馬種群產卵率增高、成熟時間縮短(De Vriesetal., 2004)。去除西花薊馬的腸道細菌，能否影響西花薊馬種群數量或降低西花薊馬的存活率？為此本試驗利用薄膜飼喂法和葉片浸漬法對氨芐青霉素、硫酸鏈霉素和氯霉素3種常用抗生素處理西花薊馬，以明確抗生素處理后對西花薊馬毒害作用以及腸道細菌的去除效果，并為進一步明確腸道菌的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 抗生素

氨芐青霉素、硫酸鏈霉素和氯霉素，購買于生工生物工程(上海)股份有限公司，化學純研究專用抗生素。

1.2 供試昆蟲和植物

供試昆蟲：西花薊馬，采自貴州省貴陽市花溪區周邊蔬菜上，并在實驗室人工氣候箱(溫度25±1℃，RH 65%～70%，光照周期14 L ∶10 D)內用菜豆豆莢長期飼養。

供試植物：矮生菜豆Phaseolusvulgaris(泰國地豆王品種)種植在人工氣候室中(溫度25±1℃，RH 70%±5%，光照周期14 L ∶10 D)，以營養缽進行培育，菜豆長至兩真葉后備用。菜豆植株生長期間未受到任何損傷和病蟲危害。

1.3 抗生素的配制

稱取一定粉末狀的氨芐青霉素和硫酸鏈霉素用無菌水進行配制，氯霉素用少量的無水乙醇進行溶解再用無菌水進行配制，3種抗生素均配制成100.00 mg/mL母液備用。使用時根據需求將母液分別稀釋成50.00 mg/mL，25.00 mg/mL和12.50 mg/mL濃度，所選濃度根據查閱文獻和預實驗獲得，所配制的抗生素溶液置于-20℃保存。

1.4 抗生素不同處理方法

薄膜飼喂法處理，將沖洗干凈的菜豆葉片晾干后用研缽研磨成汁液，用300目紗布過濾獲得葉片汁液，取汁液與抗生素按所需濃度配制成液態飼料，置于-20℃保存備用。西花薊馬飼喂參考Murai裝置稍作改進(Murai and Ishii, 1982)，使用長為4 cm雙通的透明玻璃管，一端用300目紗布封口便于透氣，另一端用雙層Parafilm制成取食膜系統。

葉片浸漬法處理，參照Lin等(2015)方法，將采回的大小基本一致菜豆葉片洗凈晾干備用，將晾干的葉片置于3種不同濃度的抗生素溶液中浸泡10 s后取出晾干，然后將晾干的葉片置于底部墊有濕潤濾紙的9 cm培養皿中。

兩種方法均接入30頭西花薊馬成蟲，每種抗生素的每個濃度設置4個重復，兩種方法處理下，葉片浸漬法中對照以無菌水浸泡菜豆葉片，薄膜飼喂法中以在菜豆汁液中加入無菌水作為對照，每隔24 h更換新鮮液態飼料和葉片。處理后的西花薊馬放入人工氣候箱中(條件同上)，分別在處理后24 h、48 h和72 h調查西花薊馬的存活情況。

1.5 西花薊馬腸道可培養細菌的培養

取上述兩方法中氨芐青霉素和硫酸鏈霉素處理72 h和氯霉素處理24 h后存活的西花薊馬15頭，先用75%酒精浸泡處理10 s，再用無菌水清洗3次，去除蟲體殘留酒精，然后在超凈工作臺中切取西花薊馬腹部置于1.5 mL離心管中，用消毒好的研磨棒磨碎后，加入600 μL無菌水搖勻制成菌液。取100 μL涂LB平板(LB培養基：NaCl 10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，15.0 g/L瓊脂粉)，37℃培養24 h后觀察腸道可培養細菌的生長情況。

1.6 數據處理及分析

使用Excel 2013和SPSS 21.0軟件對抗生素處理后西花薊馬的死亡率進行數據統計和分析。死亡率經反正弦轉換后，用Tukey檢驗法比較不同處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 薄膜飼喂法處理下抗生素對西花薊馬死亡率的影響

薄膜飼喂法處理結果表明，不同抗生素的濃度對西花薊馬有一定致死作用(表1)。不論是對照還是氨芐青霉素所有濃度處理，西花薊馬死亡率均隨處理時間延長而明顯升高，其中50.00 mg/mL氨芐青霉素處理72 h時西花薊馬死亡率最高，分別是處理24 h和48 h的7.64倍和1.69倍。硫酸鏈霉素在12.50 mg/mL和25.00 mg/mL濃度處理下，西花薊馬的死亡率隨處理時間延長而升高，50.00 mg/mL處理下48 h和72 h間沒有明顯的差異。氯霉素的所有濃度處理在48 h和72 h沒有顯著差異且均高于24 h，其中25.00 mg/mL氯霉素處理下48 h和72 h西花薊馬死亡率均是24 h的1.45倍。

在同一時間下，西花薊馬死亡率隨濃度增加而升高，但不同抗生素處理下升高程度不同。3種抗生素處理24 h時25.00 mg/mL和50.00 mg/mL濃度死亡率無顯著差異，但均高于12.50 mg/mL和對照。氨芐青霉素處理后不論在48 h還是72 h，均是50.00 mg/mL西花薊馬死亡率最高為25.67%和43.33%，分別是對照的3.21和3.61倍。硫酸鏈霉素處理48 h時，隨濃度增加西花薊馬死亡率不斷升高，在50.00 mg/mL時達到40.00%，為對照的5.00倍，72 h下50.00 mg/mL死亡率最高為44.67%，比對照提高了32.67%。氯霉素處理后不論是48 h還是72 h西花薊馬的死亡率在3個濃度下沒有明顯的差異，但均明顯高于對照，其中48 h時西花薊馬死亡率在12.50 mg/mL濃度時為95.33%，是對照的11.92倍，濃度為25.00 mg/mL和50.00 mg/mL時西花薊馬死亡率為100.00%為對照的8.33倍。

2.2 葉片浸漬法處理下抗生素對西花薊馬死亡率的影響

葉片浸漬法處理結果表明在同一抗生素不同濃度下，西花薊馬累計死亡率隨著時間延長而升高(表2)，濃度為50.00 mg/mL氨芐青霉素在48 h 和72 h西花薊馬死亡率沒有顯著差異，對照和其余濃度下西花薊馬死亡率均為72 h顯著高于24 h和48 h，其中25.00 mg/mL氨芐青霉素處理下西花薊馬死亡率72 h分別為24 h和48 h的6.67倍和2.00倍。硫酸鏈霉素處理24 h后，西花薊馬死亡率在25.00 mg/mL和50.00 mg/mL 2個濃度下沒有差異，但明顯高于對照和12.50 mg/mL處理，在48 h時各濃度之間西花薊馬死亡率無差異，但顯著高于對照，在72 h時，死亡率在50.00 mg/mL為36.67%。氯霉素處理后，在24 h和48 h時西花薊馬的死亡率均隨濃度增加而升高，在72 h時西花薊馬死亡率在濃度為50.00 mg/mL時最高為97.67%。

表1 薄膜飼喂法處理下抗生素對西花薊馬死亡率(%)的影響

在相同時間下隨著濃度增加西花薊馬死亡率升高，氨芐青霉素處理24 h和72 h時，西花薊馬死亡率在25.00 mg/mL和50.00 mg/mL 2個濃度間沒有差異，但顯著高于對照和12.50 mg/mL處理，其中72 h時氨芐青霉素25.00 mg/mL和50.00 mg/mL時西花薊馬死亡率分別為對照的1.82倍和2.52倍，在48 h時，氨芐青霉素50.00 mg/mL處理下西花薊馬死亡率最高為20.00%，是對照的3.53倍。硫酸鏈霉素處理24 h后，西花薊馬死亡率在25.00 mg/mL和50.00 mg/mL 兩個濃度下沒有差異，明顯高于對照和12.50 mg/mL處理，48 h時各濃度之間西花薊馬死亡率無差異，但顯著高于對照，72 h時，西花薊馬的死亡率在50.00 mg/mL為36.67%，為對照的3.33倍。氯霉素處理后，在24 h和48 h時西花薊馬的死亡率均隨濃度增加，死亡率明顯升高，在72 h時西花薊馬死亡率在濃度為50.00 mg/mL時為97.67%為對照的8.88倍。

薄膜飼喂法和葉片浸漬法飼喂抗生素后，西花薊馬累計死亡率在2種處理方式下不同。在相同濃度和時間下均為薄膜飼喂法>葉片浸漬法。其中50.00 mg/mL氨芐青霉素處理后，薄膜飼喂法下西花薊馬死亡率為葉片浸漬法的1.57倍。50.00 mg/mL鏈霉素處理后，薄膜飼喂法下造成西花薊馬死亡率是葉片浸漬法的1.90倍。50.00 mg/mL氯霉素處理后，薄膜飼喂法下造成西花薊馬死亡率比葉片浸漬法提高了41.00%。

2.3 薄膜飼喂法處理下抗生素對西花薊馬腸道細菌的去除效果

由于氯霉素的任何濃度在兩種處理方式下導致西花薊馬死亡率較大，48 h和72 h時使得剩余蟲量較少不足以進行腸道內細菌的培養，為驗證氯霉素對西花薊馬腸道可培養細菌的去除效果，因此本文選擇氯霉素處理西花薊馬24 h后進行腸道可培養細菌的去除效果實驗，選擇氨芐青霉素和硫酸鏈霉素2種抗生素處理72 h后對西花薊馬腸道細菌的去除實驗。薄膜飼喂法研究結果顯示，3種抗生素處理對西花薊馬腸道細菌有不同程度的抑菌作用(圖1)。取食12.50 mg/mL和25.00 mg/mL濃度的氨芐青霉素西花薊馬腸道可培養細菌相對較少，在50.00 mg/mL時可培養細菌豐度與對照基本相同。取食含硫酸鏈霉素液態飼料的西花薊馬腸道可培養細菌數量隨濃度的增加而減少，且在50.00 mg/mL時可培養細菌幾乎全部被抑制。氯霉素處理西花薊馬24 h后，西花薊馬腸道可培養細菌在濃度12.50 mg/mL和25.00 mg/mL時與對照類似，在濃度50.00 mg/mL時可培養細菌與對照相比受到抑制，但未能完全去除。

表2 葉片浸漬法處理下抗生素對西花薊馬死亡率(%)的影響

圖1 抗生素薄膜飼喂法對西花薊馬腸道可培養細菌的去除效果Fig.1 Effect of antibiotics on the removal gut culturable bacteria in Frankliniella occidentalis at membrane feeding method

2.4 葉片浸漬法處理抗生素對西花薊馬腸道細菌的去除效果

葉片浸漬法研究結果表明，對照的可培養細菌豐度明顯高于氨芐青霉素和硫酸鏈霉素2種抗生素處理組，且不同抗生素抑菌效果存在差異(圖2)。氨芐青霉素處理顯示，在濃度為25.00 mg/mL時抑菌效果較好，僅觀察到少數菌落，在50.00 mg/mL和12.50 mg/mL時均與對照類似。硫酸鏈霉素處理下，隨著濃度的增加，西花薊馬腸道可培養細菌豐度降低，僅在LB培養基中觀察到少量菌落。氯霉素處理24 h后，西花薊馬腸道可培養細菌在任何濃度下均與對照類似。

3 結論與討論

本研究表明，西花薊馬在3種抗生素3個濃度處理下均隨時間的延長累計死亡率升高，但死亡率的大小與抗生素的處理方式、種類和濃度密切相關。同一抗生素不同濃度處理對西花薊馬致死率均在24 h時不同濃度之間的差異較小，隨時間延長，不同濃度造成的死亡率差異變大。前人也有類似的發現，如Lin等(2015)研究表明隨著利福平和硫酸鏈霉素濃度增加對小菜蛾毒害作用增大死亡率升高；Vistto等(2009)研究不同抗生素對大豆夜蛾Anticarsiagemmatalis腸道細菌的抗敏感性發現增加四環素的濃度造成大豆夜蛾更高的致死率。本研究還發現不同抗生素對西花薊馬死亡率為氯霉素>硫酸鏈霉素>氨芐青霉素。林曉麗等(2014)的研究也表明，不同抗生素對小菜蛾的致死作用不同，并且硫酸鏈霉素處理組致死率較低。

圖2 抗生素葉片浸漬法飼喂對西花薊馬腸道可培養細菌去除效果的影響Fig.2 Effect of antibiotics on the removal gut culturable bacteria in Frankliniella occidentalis at leaf dipping method

同種抗生素不同的處理方式會產生不同的致死效果。在本研究中3種抗生素相同時間和濃度下西花薊馬致死率均是薄膜飼喂法高于葉片浸漬法。可能是因為薄膜飼喂法取食系統是將葉片研磨、過濾取其汁液和抗生素一同配置成較均勻的液態飼料，因此西花薊馬銼吸能很好的獲得液態飼料中的抗生素。而葉片浸漬處理，抗生素主要存在葉片表面，滲透到葉肉組織中的含量較少，從而導致以銼吸葉肉細胞液為主的西花薊馬僅能取食到含量相對較少的抗生素，進而對西花薊馬致死影響較小。張曉晨等(2018)研究抗生素對美棘薊馬Echinothripsamericanus(Morgan)的Wolbachia影響時也發現使用薄膜飼喂法造成的死亡率高于涂抹法，而涂抹法類似于葉片浸漬法。

本文探討了抗生素在一定時間內對西花薊馬腸道可培養細菌的去除效果，結果表明飼喂硫酸鏈霉素后，西花薊馬腸道可培養細菌隨濃度增加去除效果越明顯。蘇奇等(2012)使用利福平、氨芐青霉素和硫酸卡那霉素3種抗生素去除煙粉虱共生菌Hamiltonella時也發現濃度越高，去除效果越好。使用氨芐青霉素處理后隨濃度增加可培養細菌數量減少，在濃度為25.00 mg/mL時去除效果較好，但繼續升高濃度可培養細菌數量反而增多。前人在小菜蛾研究中也存在類似情況，在青霉素處理72 h后細菌數量不再下降，甚至略有回升(林曉麗, 2014)。原因可能是這些昆蟲適應力非常強，隨著抗生素的攝入，產生了某種適應力，也可能某些細菌已經對抗生素產生了抗性(Yulinetal., 2012; Ignasiak and Maxwell, 2017; Banseptetal., 2019)。以薄膜飼喂法飼喂氯霉素24 h后在濃度為12.50 mg/mL和25.00 mg/mL未見去除效果，將濃度增加到50.00 mg/mL時去除效果較好，張曉晨等(2018)研究利福平對美棘薊馬共生菌Wolbachia的去除作用時表明，濃度越高去除效果越好。

本研究表明，3種抗生素可明顯造成西花薊馬死亡率升高和有效去除西花薊馬腸道可培養細菌，但去除西花薊馬腸道細菌后對其個體發育和種群數量的影響還需要進一步的研究，這也為后期研究西花薊馬腸道細菌的功能奠定了基礎。