兩種抗生素對攜帶Wolbachia的短管赤眼蜂生殖模式的影響

張美嬌，王 軒，李遠(yuǎn)玉，林良冠，潘志萍，何曉芳*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院昆蟲學(xué)系，廣州 510642；2.廣東省科學(xué)院動物研究所，廣州520620)

Wolbachia是一種常見的細(xì)胞內(nèi)共生菌，自然界中66%節(jié)肢動物感染了Wolbachia(Hilgenboecker, 2008)。在長期的進(jìn)化過程中，Wolbachia擁有了以下調(diào)控宿主生殖方式的能力：導(dǎo)致宿主的胞質(zhì)不相容、誘導(dǎo)孤雌生殖、導(dǎo)致雄性個體的雌性化、雄性致死性、增強(qiáng)繁殖力等(Stouthameretal.，1990；O’Neilletal.，1992；Girinetal.，1995；Hurstetal.，1999；Stouthameretal.，1999)。

赤眼蜂TrichogrammaWestwood的性別決定為單倍/雙倍體型(Heimpel & Boer，2008)。無雌雄交配條件下，產(chǎn)生單倍體的雄蜂。有雌雄交配條件下，產(chǎn)生雙倍體的雌蜂。但一些赤眼蜂在感染W(wǎng)olbachia后，會由產(chǎn)雄孤雌生殖轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)雌孤雌生殖(Stouthameretal.，1990)。由于在生產(chǎn)應(yīng)用上，僅飼養(yǎng)雌蜂比飼養(yǎng)兩種性別的赤眼蜂節(jié)約更多的生產(chǎn)成本;而且在田間釋放時，具有產(chǎn)雌孤雌生殖能力的赤眼蜂更利于建立田間種群。如何利用Wolbachia對赤眼蜂生殖調(diào)控則向著更節(jié)約、更高效的目標(biāo)進(jìn)行研究。因此，不少研究都想獲得更多的產(chǎn)雌孤雌生殖的赤眼蜂品系。

短管赤眼蜂Trichogrammapretiosum是南美洲地區(qū)應(yīng)用最廣泛的天敵寄生蜂。尤其在發(fā)現(xiàn)Wolbachia對短管赤眼蜂具有誘導(dǎo)產(chǎn)雌孤雌生殖的行為調(diào)控現(xiàn)象后(Stouthamer & Kazmer，1994)，其調(diào)控機(jī)制一直是個研究熱點問題(Rijesh，2014；Russelletal.，2018)。目前短管赤眼蜂的基因組及其體內(nèi)感覺的Wolbachia基因組都已經(jīng)公布(Lindseyetal.，2016；Lindsey，2017；Lindseyetal.，2018)，但是具體的機(jī)制仍待研究。其中一個最關(guān)鍵的問題是獲得陰性的無感染W(wǎng)olbachia短管赤眼蜂品系作為陰性對照是一系列研究的必要條件。

在之前的報道有利用四環(huán)素和高溫分別對多種赤眼蜂體內(nèi)的Wolbachia進(jìn)行處理，以消除其體內(nèi)的Wolbachia，獲得陰性的無感染W(wǎng)olbachia赤眼蜂品系。但是多位研究者的實驗結(jié)果表明，四環(huán)素和高溫并不能完全去除短管赤眼蜂體內(nèi)的Wolbachia或獲得100%的孤雌產(chǎn)雄后代(Stouthameretal.，1990；潘雪紅和何余容，2010；陳茜等，2016；董輝等，2016；張志凌，2016；寧素芳，2017)。

環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)和磺胺嘧啶(sulfadiazine)均為廣譜抑菌劑。其中環(huán)丙沙星通過抑制細(xì)菌DNA解旋酶，阻止細(xì)菌復(fù)制而達(dá)到抑菌作用(Davisetal.，1996)。環(huán)丙沙星對青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖甙類和四環(huán)素類耐藥菌珠均具有較高抗菌能力。磺胺嘧啶抑菌原理主要是與細(xì)菌體內(nèi)的二氫葉酸合成酶結(jié)合，阻止正常的氨基苯甲酸(PABA)作為原料合成細(xì)菌所需的葉酸，進(jìn)一步減少了細(xì)菌DNA的合成，從而抑制細(xì)菌的生長繁殖(García-Galánetal.，2008)。磺胺嘧啶對大多數(shù)革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑制作用。

本實驗利用兩種抗生素環(huán)丙沙星和磺胺嘧啶的3個濃度對短管赤眼蜂進(jìn)行了處理，觀察短管赤眼蜂孤雌產(chǎn)雄的生殖方式是否發(fā)生改變，能否獲得完全孤雌產(chǎn)雄的后代，從而為進(jìn)一步研究Wolbachia在對短管赤眼蜂生殖性別調(diào)控的機(jī)制提供條件。

1 材料方法

1.1 供試?yán)ハx

試驗短管赤眼蜂種群購自美國，通過雄外生殖器特征進(jìn)行形態(tài)鑒定及ITS2測序分子鑒定(Stouthameretal.，1998)。體內(nèi)的Wolbachia利用wsp特異引物進(jìn)行擴(kuò)增及測序鑒定(Baldoetal.，2006)。在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)25℃，相對濕度為70%～80%，光周期為16 L ∶8 D的條件下用米蛾卵Corcyracephalonica繁殖，經(jīng)過多代飼養(yǎng)，穩(wěn)定繁殖。

1.2 試劑配制

環(huán)丙沙星，磺胺嘧啶購于廣州健陽生物公司。利用兩種抗生素的3個濃度對短管赤眼蜂進(jìn)行了處理，將環(huán)丙沙星、環(huán)丙沙星:磺胺嘧啶=1 ∶1、磺胺嘧啶分別用30%蜂蜜水稀釋為0.1 mg/mL、1.0 mg/mL、10 mg/mL的抗生素蜂蜜水。

1.3 抗生素對短管赤眼蜂生殖行為的影響

由于原短管赤眼蜂為孤雌產(chǎn)雌種群，不存在雄性個體。因此選擇在雌蜂羽化后進(jìn)行單蜂繁殖建立本實驗種群。在體視鏡下用小毛筆取出剛羽化的短管赤眼蜂雌蜂，單頭放入指形管內(nèi)，分別飼喂含有3種抗生素蜂蜜水。并設(shè)置30%蜂蜜水無抗生素為對照組。飼喂24 h后放入不少于100粒已滅胚的新鮮米蛾卵制作成的卵卡進(jìn)行產(chǎn)卵寄生。寄生24 h后用小毛筆挑出赤眼蜂放入離心管于-30℃保存。帶有被寄生卵卡的指形管繼續(xù)放入氣候箱培養(yǎng)，溫度25℃，相對濕度80%～85%，光照條件14 L ∶10 D。每個處理進(jìn)行3組重復(fù)。連續(xù)處理2代，記錄F0和F1代處理米蛾卵變黑個數(shù)即赤眼蜂產(chǎn)卵量，F(xiàn)1和F2代的羽化、雌性、雄性和雌雄鑲嵌體個數(shù)，計算羽化率、雌雄性比。分析試驗數(shù)據(jù)用SPSS 24.0軟件，采用one-way ANOVA和Duncan’s進(jìn)行多重比較，不同世代間(F0與F1或F1與F2)的數(shù)據(jù)采用t檢驗進(jìn)行分析。各參數(shù)統(tǒng)計計算如下：

產(chǎn)卵量的計算：接蜂后的第7天計錄下每張卵卡上變色(黑)的卵粒數(shù)作為單頭雌蜂的產(chǎn)量卵。

羽化率的計算：當(dāng)小試管中出現(xiàn)成蜂開始記錄所有羽化的成蜂頭數(shù)，以成蜂數(shù)/產(chǎn)卵量×100%作為羽化率。

產(chǎn)雄率的計算：每代的蜂死亡后，在100倍體視鏡下根據(jù)觸角形態(tài)特征和腹部是否具有產(chǎn)卵器來區(qū)分雌雄。觸角毛較長，其中最長的觸角毛是鞭節(jié)最寬處的2.5倍，作為雄性的主要外部形態(tài)特征。雌蜂觸角毛較短，腹部具有產(chǎn)卵器。雌雄相嵌體的判斷依靠觸角的特征與是否具有產(chǎn)卵器的特征進(jìn)行區(qū)分，如果有產(chǎn)卵器但觸角表現(xiàn)為雄性特征或無產(chǎn)卵器但觸角表現(xiàn)為雌性的個體都判斷為雌雄相嵌體。

產(chǎn)雄率(%)=雄性個體數(shù)/總羽化個體數(shù)×100

雌雄相嵌體比率(%)=雌雄相嵌體個體數(shù)/總羽化個體數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素對短管赤眼蜂產(chǎn)卵量的影響

多組抗生素處理中除10 mg/mL的環(huán)丙沙星:磺胺嘧啶=1 ∶1處理呈現(xiàn)出F1代比F0代的產(chǎn)卵量顯著高以外(t=-3.18，P=0.04)，其余各處理在世代間的產(chǎn)卵量沒有差異(表1)。與對照組僅喂食蜂蜜水相比，喂食抗生素與蜂蜜水混合的F0代在產(chǎn)卵量上產(chǎn)生了各種變異。環(huán)丙沙星處理產(chǎn)卵量比對照具有高的產(chǎn)卵量，而且呈現(xiàn)濃度低的處理產(chǎn)卵量比濃度高的處理更高的產(chǎn)卵量。雖然這些差異并沒達(dá)到顯著水平。與對照組相比，含有磺胺嘧啶的6個處理獲得的產(chǎn)卵量都偏低，尤其0.1 mg/mL的環(huán)丙沙星:磺胺嘧啶=1 ∶1處理的產(chǎn)卵量顯著地低于對照組(df=6，F(xiàn)=2.39，P=0.01)(表1)。

2.2 抗生素對短管赤眼蜂羽化率的影響

各處理在世代間的羽化率僅在0.1 mg/mL的環(huán)丙沙星:磺胺嘧啶=1 ∶1處理的F2代顯著地低于F1代(t=4.27，P=0.01)。其它的處理在世代間沒有差異。F1世代的羽化率各處理間無顯著差異(df=9，F(xiàn)=1.08，P=0.42)。F2世代中，0.1 mg/mL的環(huán)丙沙星 ∶磺胺嘧啶=1 ∶1處理的羽化率顯著地低于對照及其它濃度處理(df=7，F(xiàn)=3.03，P=0.03)(表1)。

2.3 抗生素對短管赤眼蜂子代性別的影響

抗生素對短管赤眼蜂產(chǎn)雄率的影響中能看出，在F1代中，所有的處理都不曾出現(xiàn)雄性個體。從F2代開始，含有磺胺嘧啶的處理就開始出現(xiàn)了雄性個體，并且當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL以上的處理中出現(xiàn)了100%的雄性后代，顯著地高于其它的處理(df=9，F(xiàn)=31.93，P=0.00)。0.1 mg/mL的環(huán)丙沙星 ∶磺胺嘧啶=1 ∶1處理中F2代出現(xiàn)了1頭雌雄相嵌體，其雌雄相嵌體比率與其它處理存在顯著差異(df=9，F(xiàn)=3.31，P=0.01)(表1)。但是環(huán)丙沙星經(jīng)過6代的篩選仍然未能獲得雄性的后代(數(shù)據(jù)未例出)。

3 結(jié)論與討論

在某些赤眼蜂中，Wolbachia降低了赤眼蜂的生殖力的同時(Hoogenboometal.，1998；Luck，2000；Silvaetal.，2000)，縮短寄主壽命及影響嗅覺反應(yīng)等寄生行為(潘雪紅等，2007；張海燕等，2013)。本論文利用前人不曾使用過的兩種抗生素嘗試去除了短管赤眼蜂體內(nèi)的Wolbachia，并觀察處理后對其生殖行為的影響。

3.1 抗生素對產(chǎn)卵量的影響

抗生素對赤眼蜂產(chǎn)卵量呈現(xiàn)出多種影響效果。通過四環(huán)素飼喂幼蟲的方式去除短管赤眼蜂和廣赤眼蜂Trichogrammaevanescens體內(nèi)的Wolbachia的實驗發(fā)現(xiàn)，去除體內(nèi)Wolbachia的短管赤眼蜂呈現(xiàn)出較低的產(chǎn)卵量(潘雪紅和何余容，2010)，但對廣赤眼蜂的產(chǎn)卵量沒有影響(Grenieretal.，2002)。本研究結(jié)果顯示：與對照相比，環(huán)丙沙星對攜帶的短管赤眼蜂產(chǎn)卵量無抑制作用。磺胺嘧啶處理會降低F0代的產(chǎn)卵量，尤其當(dāng)磺胺嘧啶與環(huán)丙沙星混配使用時，抑制產(chǎn)卵量的效果更明顯。但F1代的產(chǎn)卵量都呈現(xiàn)回升。這個結(jié)果與前人多個實驗結(jié)果類似。而經(jīng)過多代的抗生素處理后(8代左右)，赤眼蜂的產(chǎn)卵量在連續(xù)的世代間會呈現(xiàn)出一種先降低隨后又呈上升趨勢波動狀的影響(潘雪紅和何余容，2010；董輝等，2016)。但根據(jù)長達(dá)27個世代的觀察研究發(fā)現(xiàn)，用抗生素去除后Wolbachia的短管赤眼蜂總寄生產(chǎn)卵量比感染的短管赤眼蜂要低(Grenieretal.，2002)。

3.2 抗生素對短管赤眼蜂羽化率的影響

鹽酸四環(huán)素處理后松毛蟲赤眼蜂后代羽化率在同一鹽酸四環(huán)素處理濃度下，隨著抗生素處理代數(shù)的增加呈先降低后升高的趨勢(董輝等，2016)。本實驗僅在0.1 mg/mL環(huán)丙沙星 ∶磺胺嘧啶=1 ∶1處理中體現(xiàn)出F2代的羽化率比F1代的羽化率顯著偏低外，其它的處理羽化率都不低于對照處理。

3.3 抗生素對短管赤眼蜂子代性別的影響

去除赤眼蜂體的Wolbachia，最常用的方法是高溫(>30℃)和抗生素的運用。高溫會降低赤眼蜂體內(nèi)的滴度，導(dǎo)致產(chǎn)雌孤雌生殖的赤眼蜂在其后代中產(chǎn)生雄蜂或雌雄相嵌體(Tulgetske & Stouthamer，2012)。但是高溫通常也會降低赤眼蜂的存活率及產(chǎn)卵量(潘雪紅和何余容，2010)。

抗生素處理同樣也可以使產(chǎn)雌孤雌生殖的赤眼蜂處理后代出雄蜂或雌雄相嵌體。通常使用的抗生素包括四環(huán)素(tetracycline hydrochloride)、利福平(rifampicin)、磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole)、慶大霉素(gentamycin)、青霉素(pennicillin G)、紅梅素(erythromycin)等。但一些抗生素并不能使處理后的子代出現(xiàn)雄性個體(Stouthameretal.，1990)或只產(chǎn)生少量的雄性個體(張志凌，2016)。同樣，本研究單獨利用環(huán)丙沙星的處理不能獲得雄性個體。前人的多個實驗中，即使成功獲得了產(chǎn)雄孤雌生殖的個體，但由于這些抗生素不是100%去除赤眼蜂體的Wolbachia，導(dǎo)致只要含有微量Wolbachia，不是100%去除Wolbachia的赤眼蜂種群中，在其后代也能恢復(fù)產(chǎn)雌孤雌生殖的行為(Stouthameretal.，1990)。

利用濃度高達(dá)100 mg/mL或30 mg/mL的四環(huán)素處理產(chǎn)雌孤雌生殖短管赤眼蜂或松毛蟲赤眼蜂成蟲，即使經(jīng)過5代以上的處理，仍不能出現(xiàn)100%雄性后代，其后代雌性個代仍高達(dá)60%以上(Stouthameretal.，1990；潘雪紅和何余容，2010)。本實驗利用1.0 mg/mL磺胺嘧啶或利用環(huán)丙沙星與磺胺嘧啶混用對攜帶Wolbachia的短管赤眼蜂進(jìn)行處理后，在F2代就已經(jīng)出現(xiàn)了100%的雄性個體。這些處理主要起作用的應(yīng)當(dāng)是磺胺嘧啶。推薦單獨利用1.0 mg/mL磺胺嘧啶對攜帶Wolbachia的短管赤眼蜂進(jìn)行的去除Wolbachia實驗，這種方法更方便、省時，并且獲得完全雄性后代。