乳酸乳球菌硫胺素轉運蛋白ThiT提高酸耐受性的機制

朱政明，張 娟，堵國成，3，吳志猛

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；3.江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

應用微生物細胞工廠進行相關代謝產物的發酵法生產已廣泛應用于食品、化工、醫藥、紡織等眾多領域[1]。在這些工業產品的發酵法生產過程中，由于碳代謝流的轉化，其導致的產酸積累是微生物代謝過程中必不可少的部分[2]。微生物的代謝產酸對促進細胞能量轉化、增強本體細胞的環境競爭性等具有積極的作用。然而，隨著胞內代謝產物持續不斷積累，導致胞內pH不斷下降，從而使得維持細胞正常生理功能的相關酶類活性受到嚴重抑制，影響了細胞的代謝活性和細胞結構的完整性。另外細胞膜流動性的降低影響了胞內外物質的轉運，并為下游的加工處理以及工業排放物的治理埋下了諸多隱患[3]。因此，提高微生物細胞的酸脅迫耐受性，增強其在酸性環境下的代謝活性與生產效率，成為學術界和產業界急需解決的問題。

基于對微生物酸脅迫耐受性機制的深入解析，提高微生物細胞對酸脅迫環境的耐受性已成為微生物生理功能研究的重要組成部分。近年來，隨著合成生物學和系統生物學技術的快速發展，新技術的出現為微生物耐酸機制的解析、抗酸脅迫元器件的發掘和構建奠定了堅定的理論與技術基礎。目前，對抗酸脅迫元器件的研究主要集中于對相關結構基因、調控基因以及代謝/解毒模塊的研究。對結構基因抗酸元器件的研究主要集中于F1F0-ATPase、脲酶等多亞基編碼蛋白的結構解析及功能驗證[4-5]。對調控基因型抗酸元器件的研究目前主要集中于對分子伴侶、應激蛋白的功能解析及分子改造[6-7]。解毒/代謝模塊是抗酸元器件中的重要組成部分，目前對其中的精氨酸脫氨酶系統（Arginine deiminase，ADI）和鯡精氨脫氨酶系統（Agmatine deiminase system，AgDS）已進行了較為深入的研究[8]。

目前關于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）中酸脅迫耐受性提升的研究已有部分報道。Wu等通過在L.lactis NZ9000中異源表達來自干酪乳桿菌的DNA修復蛋白RecO，提升了菌株對酸脅迫的耐受性以及乳酸產量[9]。Abdullah等通過在L.lactis NZ9000中異源表達來自大腸桿菌的分子伴侶DNA蛋白，重組菌株在0.5 g/dL的乳酸（pH 5.47）脅迫下，其最大生物量是對照菌株的1.44倍[7]。此外，研究發現在L.lactis MG1363中過量表達小熱休克蛋白Lo18，明顯提升了菌株對酸脅迫和熱脅迫的耐受性[10]。關于L.lactis中酸脅迫耐受性提升的研究主要集中于對分子伴侶、熱休克蛋白等一些應激蛋白的研究，而關于其他類型的功能蛋白尤其是轉運蛋白幫助乳酸乳球菌細胞提升酸脅迫耐受性目前還缺乏深入研究。

已有研究發現，在單核細胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）中通過敲除thiT基因，敲除菌株對酸脅迫敏感，其對酸脅迫的耐受性低于未敲除thiT基因的對照菌株[11]。另外研究發現，在釀酒酵母中通過外源添加硫胺素可幫助細胞抵御氧脅迫[12]。基于此，本研究中通過在乳酸乳球菌中過表達ThiT轉運蛋白，考察了重組菌株對酸脅迫耐受性的影響，并利用比較轉錄組學技術研究了重組菌株耐受酸脅迫的具體響應機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質粒本研究中所用的菌株和質粒詳見表1。

1.1.2 主要試劑Prime STAR（mix）DNA聚合酶、PCR產物純化試劑盒以及T4 DNA連接酶：購自TaKaRa公司；RNA提取試劑盒：購自天根生物科技有限公司；限制性內切酶Nco I和Xba I：購自Thermo Scientific公司；Nisin：購買自Sigma公司；蛋白胨、酵母粉以及M17肉湯培養基：購買自Oxoid公司；其他常規試劑均為國產分析純。引物合成及測序均由上海生工有限公司完成。實驗中，氯霉素添加的質量濃度分別為大腸桿菌中添加質量濃度為100μg/mL，乳酸乳球菌中添加質量濃度10μg/mL。誘導劑Nisin的添加質量濃度為10 ng/mL。

表1 研究所用的菌株及質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.3 培養基LB培養基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；pH 7.4。GM17培養基：M17培養基補充5 g/L葡萄糖。

1.2 方法

1.2.1 質粒和菌株的構建pNZ8148/thiT的構建過程如圖1所示。首先以乳酸乳球菌 （L.lactis NZ9000）的基因組DNA為模板，以pNZ8148/thiT-F和pNZ8148/thiT-R為引物，通過PCR擴增并膠回收得到片段thiT；然后將表達質粒pNZ8148和片段用Nco I和Xba I雙酶切，酶切產物純化后用T4 DNA連接酶連接6～8 h；連接產物轉化E.coli MC1061，最后用引物pNZ8148-F和pNZ8148-R進行菌落PCR驗證，并挑取條帶大小約800 bp的克隆子進行測序驗證，得到質粒pNZ8148/thiT。所用引物序列見表2。將空質粒pNZ8148和重組質粒pNZ8148/thiT電轉化進入L.lactis NZ9000，通過氯霉素抗性的平板篩選獲得對照菌株L.lactis（Vector）和重組菌株L.lactis（ThiT）。

圖1 pNZ8148/thiT質粒的構建Fig.1 Construction of plasmid pNZ8148/thiT

表2 本研究所用的引物及序列Table 2 Primers used in this study

1.2.2 生長曲線的測定將經過活化的種子培養液以體積分數2%的接種量接入GM17培養基（含10μg/mL的氯霉素），30℃靜置培養至OD6000.4左右，加入10 ng/mL的Nisin誘導培養。每隔2 h取樣，使用多功能酶標儀測定OD600處的吸光值，以GM17培養基為空白對照。最后以OD600為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制對照菌株和重組菌株的生長曲線。每個菌株測定3個平行，計算其平均值。

1.2.3 酸脅迫下的存活率測定根據1.2.2生長至OD6000.4左右的菌液加入10 ng/mL的Nisin誘導培養（5 h），取4 mL的菌液于8 000 g離心5 min后用等體積的生理鹽水（0.85 g/dL）洗滌離心2次，加入等體積的脅迫培養基（GM17，pH 4.0，含10μg/mL的氯霉素和10 ng/mL的Nisin）進行脅迫處理。分別脅迫不同的時間取樣后，離心洗滌，用生理鹽水等體積重懸后梯度稀釋至適宜的菌體濃度，然后取10 μL分別點樣于GM17的固體平板上，于30℃條件下培養24 h左右。最后進行菌落計數并計算存活率，存活率的計算方法參考之前報道的方法[16]。

1.2.4 RNA樣品的提取將誘導培養至對數中期（4 h）的微生物細胞于8 000 g離心5 min后用預冷的50 mmol/L的PBS（pH 7.4）離心洗滌2次后收集菌體，加入等體積的脅迫培養基（GM17，pH 4.0，含10μg/mL的氯霉素和10 ng/mL的Nisin）進行脅迫處理。然后分別脅迫0 h和2.5 h后離心洗滌并收集菌體，迅速放入液氮中凍存。最后采用液氮研磨菌體，并按照RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit說明書提取總RNA。使用NanoDrop ND-2000對純化的RNA進行定量并將其保存于-80℃冰箱。

1.2.5 轉錄組學分析RNA樣品送往南京諾唯贊生物有限公司進行轉錄組測序。轉錄組測序所得的數據成為raw data，隨后對raw data進行質控（QC）。質控后，經過濾得到clean reads，然后用HISAT2[17]將clean reads比對到參考序列上。比對完，通過統計reads在參考序列上的分布情況和覆蓋度，以此判斷比對結果是否可靠。之后采用RSEM[18]計算基因的表達量。差異表達基因的分析采用DEGseq[19]的方法進行分析。我們將差異倍數為2倍以上且pValue≤0.05的基因篩選為顯著差異表達基因。基于Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數據庫，采用phyper對分別差異基因進行GO功能富集分析和pathway功能富集分析，隨后對pValue進行FDR校正，并以FDR≤0.01的功能視為顯著富集。

2 結果與分析

2.1 重組菌株的生長性能分析

為了考察過表達ThiT轉運蛋白對乳酸乳球菌生長的影響，實驗測定了乳酸乳球菌在正常生長條件下的生長曲線。如圖2（a）所知，根據生長曲線可以確定對數中期的培養時間約為4 h。同時，圖2所示的重組菌株和對照菌株的生長情況基本相同，在對數期重組菌株的菌體濃度略微低于對照菌株，且生長過程中2株菌株的環境pH基本相同。推測這可能是由于加入Nisin誘導培養后，重組菌株由于重組蛋白開始快速表達，給菌體細胞的代謝造成一定的代謝負擔所導致[20]。

圖2 L.lactis的生長分析Fig.2 Growth analysis of L.lactis

2.2 過表達ThiT提高L.lactis NZ9000的酸脅迫耐受性

基于重組菌株的生長情況，實驗進一步考察了對照菌株和重組菌株在酸脅迫條件下的存活率。在乳酸乳球菌代謝過程中，隨著主要代謝產物乳酸的不斷積累，胞外pH也隨之不斷地下降，最低可降至pH 4.5～5.0，而在pH 4.0的條件下，乳酸乳球菌的存活率迅速下降。因此本研究中選擇pH 4.0作為考察乳酸乳球菌存活率的實驗pH[21-22]。

如圖3所示，經過pH 4.0脅迫處理后，重組菌株的存活率明顯高于對照菌株，且隨著脅迫時間的延長，兩者之間的差距逐漸增大，在脅迫2.5 h后，兩者之間存活率差距達到最大，此時重組菌株的存活率是對照菌株的16.2倍。在脅迫3 h后，2株菌之間的存活率差距有所縮小，重組菌株的存活率是對照菌株的2.4倍。通過存活率實驗，發現過表達ThiT轉運蛋白可顯著提高乳酸乳球菌的酸脅迫耐受性。

圖3 酸脅迫條件下過表達ThiT對L.lactis NZ9000存活率的影響Fig.3 Effect of ThiT overexpression on the survival rates of L.lactis NZ9000 during acid stress

2.3 過表達ThiT對乳酸乳球菌轉錄組水平的影響

為進一步揭示ThiT轉運蛋白幫助細胞耐受酸脅迫的具體作用機制，通過比較轉錄組分析研究了對照菌株和重組菌株在酸脅迫前后的轉錄水平變化。如圖4所示，在正常培養條件下，與對照菌株相比，重組菌株差異表達基因有207個，其中有116個基因發生了顯著上調，91個基因發生了顯著下調。另外，在酸脅迫條件下，相比較對照菌株，重組菌株差異表達基因有201個，其中有99個基因發生了顯著上調，102個基因發生了顯著下調。兩組比較情況下，共155個基因同時出現了顯著上下調，初步分析這些顯著差異表達的基因可能和乳酸菌細胞抵御酸脅迫有關。

圖4 2株菌在正常（pH 7.0）和酸脅迫（pH 4.0）條件下的差異基因分析Fig.4 Significant differentially expressed genes in the recombinant strain relative to the parent strain at pH 7.0 and pH 4.0

為進一步揭示這些差異表達基因參與的具體細胞生理功能和代謝途徑，分別對兩組比較情況下的差異基因進行GO和Pathway功能富集分析。由圖5可知，GO功能顯著性分析發現在正常培養條件下，重組菌株中差異表達的基因主要參與轉運過程，尤其是營養物質如糖類物質的轉運（圖5（a））。同樣地，在酸脅迫條件下，重組菌株中差異表達的基因主要參與碳水化合物的轉運和轉膜的過程（圖5（b））。由此可以分析過表達ThiT轉運蛋白可提高細胞對碳水化合物的轉運能力，酸脅迫條件下碳水化合物轉運的增強可為提高抵御酸脅迫提供更多的能量[23]。通過Pathway顯著性富集發現在正常培養和酸脅迫條件下，差異表達基因主要參與PTS途徑和糖代謝途徑 （圖5（c）、（d））。差異基因的Pathway富集結果和GO的富集分析結果成正相關性，進一步解釋了GO富集分析的結果。

為深入解析在兩組比較情況下，共有差異基因參與的細胞功能和代謝過程。進一步對共有的差異基因進行GO和Pathway富集分析發現，這些共有的差異基因主要參與細胞的胞內外物質的轉運過程，尤其是對糖類等營養物質的轉運（圖6（a）（b））。為了應對酸脅迫的環境，細胞通過加強營養物質的轉運，從而強化細胞的碳代謝途徑，以提供更多的能量，提供的能量在細胞抵御酸脅迫的過程中被消耗掉，從而幫助細胞更好地抵御酸脅迫的環境[24]。

前期研究發現，酸脅迫條件下，過表達ThiT蛋白對胞內外物質的轉運過程具有較大影響，因此本研究中對轉運過程中的相關差異基因進行了具體分析。見圖7（a），oppD（ABC家族的ATP結合的轉運蛋白）、oppF（寡肽轉運的ATP結合蛋白）、bioY（生物素轉運蛋白）和busAA（甘氨酸、甜菜堿ABC轉運ATP結合蛋白）等基因在正常以及酸脅迫條件下均發生了顯著上調。OppD和OppF都屬于ABC家族的寡肽轉運蛋白，它們的顯著上調可幫助細胞在酸脅迫條件下更高效地轉運寡肽，而轉運到胞內的寡肽可被分解成氨基酸，多種氨基酸已被證實可幫助細胞抵御酸脅迫的損傷。Wang等通過在唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）中過表達寡肽轉運底物結合蛋白OppA明顯提高了重組菌株對多種脅迫的耐受性[25]。此外，busAA基因的顯著上調，可幫助酸脅迫條件下的細胞更多地轉運甘氨酸和甜菜堿等物質，而甜菜堿已被證實可提高細胞的酸脅迫耐受性[26]。作者繼續考察了過表達ThiT蛋白對胞內硫胺素合成途徑中關鍵基因的影響。如圖7（b）所示，在正常條件和酸脅迫條件下，過表達ThiT蛋白，顯著提高了thiT基因的轉錄水平，其轉錄水平分別提高了699和1 859倍，說明thiT基因在L.lactis NZ9000中成功轉錄，且其轉錄水平得到顯著提高。另外，研究發現硫胺素合成途徑中的基因thiDEM也發生了顯著上調，酸脅迫條件下過表達ThiT轉運蛋白同時提高了胞內硫胺素合成途徑中關鍵基因的表達，進一步強化胞內硫胺素的合成，從而幫助細胞更高效地抵御酸脅迫的損傷。

圖5 2株菌在正常（pH 7.0）和酸脅迫（pH 4.0）條件下的GO和Pathway富集分析Fig.5 Gene ontology and pathway classification analysis in the recombinant strain relative to the parent strain at pH 7.0 and pH 4.0

圖6 2株菌在正常（pH 7.0）和酸脅迫（pH 4.0）條件下的共有差異基因表達分析Fig.6 Common genes of significant differentially expressed in the recombinant strain relative to the parent strain at pH 7.0 and pH 4.0

圖7 2株菌在正常（pH 7.0）和酸脅迫（pH 4.0）條件下的關鍵差異基因表達分析Fig.7 Key genes of significant differentially expressed in the recombinant strain relative to the parent strain at pH 7.0 and pH 4.0

3 結語

本研究中通過過表達ThiT硫胺素轉運蛋白，考察了其對乳酸乳球菌酸脅迫耐受性的影響，并在此基礎上對重組菌株和對照菌株在正常和酸脅迫條件下進行轉錄組學分析。研究發現過表達ThiT硫胺素轉運蛋白可顯著提高細胞在酸脅迫條件下的存活率，接下來通過轉錄組學分析發現，過表達ThiT轉運蛋白可提高細胞對碳水化合物的轉運能力，從而為細胞抵御酸脅迫的耐受性提供更多的能量；此外寡肽、甜菜堿等相關轉運基因的顯著上調可幫助細胞抵御酸脅迫的損傷。作者首次報道了在乳酸菌中關于ThiT轉運蛋白提高酸脅迫耐受性的作用效果，為進一步對硫胺素代謝改造提高細胞酸脅迫耐受性提供了新的思路。同時，上述研究結果也對關于ThiT轉運蛋白在其他工業微生物中的應用提供了重要的參考意義。