肉桂精油乳液的制備及抑菌性

汪師帥，朱 蝶

（武漢商學院 食品科技學院，湖北 武漢430056）

肉桂精油是從桂皮、桂葉、桂枝等部位提取而得，為琥珀色液體，香氣強烈持久。肉桂醛是肉桂精油的主要成分，難溶于水和甘油，易溶于醇和醚類物質，能隨水蒸氣揮發，導致肉桂精油在食品中很難穩定存在[1]。肉桂醛也易發生化學降解，導致香味丟失，并產生異味，在一定程度上限制了應用[2]。

肉桂醛的抑菌性良好，對細菌、真菌等微生物具有較強的抑制作用。肉桂醛能夠使細菌的細胞膜破裂，使細菌在細胞分裂時產生畸變和異常分裂，從而對細菌的正常生長繁殖產生直接的抑制作用，導致其外觀形態發生明顯變化。此外，肉桂醛還能與細菌DNA發生相互作用，影響細菌DNA的正常合成，并能夠改變細菌內部的離子平衡，導致細菌發生解體而死亡[3]。

作者通過將肉桂精油制備成水包油型乳液，一方面探討了該乳液對離心轉速、溫度以及儲藏時間的穩定性；另一方面通過改變乳液中肉桂精油的質量分數，獲得一系列不同粒徑分布的乳液液滴。在此基礎上，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為對象，探討乳液的粒徑大小與其抑菌效果的相關性。本研究可為肉桂精油在食品加工中的有效應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉桂精油：深圳市鼎誠植物香料有限公司產品；中鏈脂肪酸（MCT，食品級）：武漢博星化工有限公司產品；吐溫80、司班20（分析純）：上海申宇醫藥化工有限公司產品；營養肉湯培養基（LB培養基，含有胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L）：上海博微生物科技有限公司產品。

大腸桿菌（Escherichia coli）與金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）來源于中國醫學菌種保藏中心。

1.2 儀器

DF-101Z集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長城科工貿有限公司產品；CJJ78-1電子天平：上海越平科學儀器有限公司產品；Zetasizer nano ZS納米粒度分析儀：英國馬爾文儀器公司產品；TG16-WS高速冷凍離心機：湘儀離心機儀器有限公司產品；JY92-IIN紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司產品；YXQ-50SII壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅有限公司產品；HCY-123C恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司產品。

1.3 肉桂精油乳液的制備

稱取一定量的肉桂精油與MCT混合均勻，逐滴加入含有乳化劑的水中。整個實驗在50℃水浴條件下進行，持續15 min。在乳液體系中，固定油相總體質量分數為5%，乳化劑（司班20∶吐溫80=1∶3，質量比）質量分數為10%，水的質量分數為85%。為了得到不同粒徑的乳液，可通過改變肉桂精油的添加量，使肉桂精油占整個乳液體系的質量分數分別為0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%。

1.4 乳液的粒徑及PDI測定

采用納米粒度儀Zetasizer nano ZS測定肉桂精油乳液的平均粒徑及多分散系數PDI值，參數設置為溫度25℃，散射角173°，折射率1.453。為降低多重光散射效應，測定前需用去離子水稀釋溶液。實驗重復測定3次取平均值，采用d4，3即體積平均粒徑表征乳液粒徑的大小。

1.5 肉桂精油乳液的穩定性測定

離心穩定性：將質量分數1.5%肉桂精油乳液于2 000～12 000 r/min的條件下離心12 min，觀察乳液是否分層。若無分層，測定其粒徑及PDI大小。每個樣品設置3個平行。

熱穩定性：將質量分數1.5%肉桂精油乳液分別放置在4、25、40、60、80℃的條件下處理30 min，測定其粒徑及PDI大小。每個樣品重復測定3次。

儲藏穩定性：將肉桂精油乳液放置于4℃和25℃條件下儲藏不同時間。每隔一段時間取樣，測定其粒徑及PDI大小。每個樣品重復測定3次。

1.6 乳液的抑菌性測定

乳液的處理：以無菌水為空白對照，實驗組為T-0.5%、T-1.5%、T-2.5%，分別對應乳液中肉桂精油的質量分數為0.5%、1.5%、2.5%。為了保證乳液中肉桂精油的質量相同，用無菌水將T-1.5%、T-2.5%分別稀釋3倍和5倍，獨立探討不同粒徑的乳液對細菌生長的抑制情況。

菌懸液的制備：用接種環從肉湯瓊脂斜面上挑取一環活化后的受試菌至LB培養基中，37℃培養18～24 h得菌懸液。

動態抑菌曲線的制作：用移液槍準確吸取200μL菌懸液于離心管中，再加入1 800μL乳液或無菌水，混勻，靜置0.5 h后放置于37℃培養。每隔一定的時間取樣，測定樣品在600 nm處的吸光度。每個樣品設置3個平行。

1.7 數據處理

所有實驗數據采用Origin 8.5軟件進行平均值和方差分析。

2 結果與分析

2.1 肉桂精油質量分數對乳液粒徑及PDI的影響

肉桂精油質量分數對乳液粒徑及PDI值的影響，如圖1所示。當肉桂精油質量分數從0.5%增大至2.0%，乳液粒徑迅速從約50 nm上升至270 nm。隨著精油質量分數進一步增加至2.5%，乳液粒徑增加緩慢。PDI值是反應乳液均一性的重要指標。PDI值越小，乳液體系均一越好[4]。圖中PDI值先減小后增大，在肉桂精油質量分數為1.5%時，PDI值達到最小，約為0.1。肉眼觀察發現當精油質量分數＜1%，乳液澄清透明，泛微藍色乳光。當精油質量分數≥1%，乳液呈現均一的乳白色。乳液外觀的差異是乳液液滴與光線作用的結果。當液滴直徑遠大于入射光波長時，主要發生光的反射，伴隨光的折射、吸收和散射，呈現乳白色、不透明的外觀；當液滴直徑稍大于入射光波長時，則有光的散射現象發生，體系呈半透明狀；當液滴直徑小于入射光波長時，光可完全透過，此時乳狀液呈透明狀。因此，可從乳液外觀粗略判斷乳液粒徑大小[5]。

圖1 肉桂精油質量分數對乳液粒徑及PDI值的影響Fig.1 Effect of cinnamon oil concentration on particlesize and PDI value of emulsion

2.2 肉桂精油乳液的離心穩定性

穩定性是評價乳液質量非常重要的指標，也決定了乳液的儲藏條件、應用范圍及有效期限[6]。如若乳液體系的穩定性差，在儲藏過程中會發生乳液液滴聚集，出現絮凝分層現象。該現象出現的快慢可評判乳液穩定性的差異。此部分通過離心這一物理方式可加速這一變化，來表征乳液的穩定性。

實驗中控制乳液中各組分的質量分數分別為肉桂精油1.5%，MCT 3.5%，乳化劑10%，水85%，制備得到乳液，比較乳液經離心處理后粒徑及PDI值的變化，結果如圖2所示。經過不同轉速（2 000～12 000 r/min）處理后，乳液的粒徑基本維持在130 nm附近。離心轉速的差異并不會導致乳液的粒徑發生明顯變化。然而，乳液PDI值隨著離心轉速增加而略微上升，說明高離心轉速會導致乳液的均一性稍有下降。此外，通過肉眼觀察發現乳液經不同轉速離心后，均未出現絮凝分層現象。由此可見該乳液具有較好的離心穩定性，體系穩定性較好。

圖2 離心轉速對乳液粒徑及PDI值的影響Fig.2 Effect of centrifugal speed on particle size and PDI value of emulsion

2.3 肉桂精油乳液的熱穩定性

為了探究此肉桂精油乳液在應用及儲藏時的溫度條件，此部分實驗將肉桂精油質量分數為1.5%的乳液放置于不同溫度條件（4～80℃）下處理30 min，來判斷乳液對熱的穩定性。從圖3可見，當溫度低于40℃，乳液的粒徑及PDI值基本不發生變化，粒徑維持在130 nm，PDI維持在0.1。而在60、80℃條件下，乳液的粒徑及PDI值陡然增加。表明高溫會破壞乳液體系的穩定性。林麗萍等[7]利用司班和吐溫系列乳化劑所制備的肉桂醛乳液在（54±1）℃條件下，貯存14 d后，出現了油析和白色沉淀。

圖3 溫度對乳液粒徑及PDI值的影響Fig.3 Effect of temperature on particle size and PDI value of emulsion

此外，通過肉眼觀察還發現乳液經過80℃處理后發生明顯的分層現象。待此樣品冷卻，搖晃，樣品又恢復均一的乳白色。司班20和吐溫80屬非離子型乳化劑，當溫度較高時，乳化劑在水中的溶解度迅速降低而析出，體系發生分層現象。該現象稱為起曇，溫度為曇點。當環境溫度低于曇點時，體系恢復澄清[8]。

2.4 肉桂精油乳液的儲藏穩定性

為了探究此肉桂精油乳液的有效使用期限，此部分實驗將不同質量分數的肉桂精油乳液置于4、25℃恒溫條件下儲藏不同時間，以乳液的粒徑為主要評價指標，考察乳液的儲藏穩定性，結果如圖4所示。在4℃條件下，儲藏1～5 d，各質量分數的肉桂精油乳液均能保持穩定，乳液粒徑基本維持不變。在儲藏第10天，各組乳液粒徑均會發生不同程度地增加。高質量分數的肉桂精油（2.5%），乳液粒徑從第7天開始增加。相比于4℃條件下所得結果，乳液在25℃條件下儲藏穩定性可延長至10 d。如圖4（b）所示，在儲藏第10天，各質量分數精油的乳液粒徑開始略微增加。由此可見，25℃更有利于該肉桂精油乳液的儲藏。分析原因為精油在低溫條件下易發生結晶，破壞乳液的界面膜，導致乳液顆粒的尺寸變大，均一性變差。此外，低溫環境會降低乳液體系的熱能，發生液滴少量聚集，亦不利于乳液的穩定性[9]。

圖4 儲藏時間對不同質量分數的肉桂精油乳液粒徑的影響Fig.4 Effect of storage time on particle size of emulsion with different cinnamon oil concentrations

2.5 肉桂精油乳液對大腸桿菌的抑制作用

為了探討肉桂精油乳液的抑菌效果，選擇上述制備的3種精油乳液T-0.5%、T-1.5%、T-2.5%，分別對應乳液中肉桂精油的質量分數為0.5%、1.5%、2.5%，乳液液滴大小為50、150、280 nm（見圖1）。用無菌水將T-1.5%、T-2.5%分別稀釋3倍和5倍，以保證乳液中肉桂精油質量分數相同，獨立探討乳液粒徑和抑菌情況的相關性。肉桂精油乳液對大腸桿菌的抑制情況，如圖5所示。未添加肉桂精油乳液的空白組中，吸光度隨著培養時間的延長一直增大。從生長曲線來看，大腸桿菌生長并未經歷調整期，而直接呈指數式增長，生長良好。與空白組相比，乳液組的吸光度則持續下降，僅僅在培養初期0～1 h，乳液組的吸光度大于空白組，這是少量乳白色的乳液對光的散射所致。含有肉桂精油的乳液組均表現出良好的抑菌性能[10-11]，且T-1.5%組抑制效果最佳。由此可見，肉桂精油乳液粒徑的不同會對大腸桿菌的動態抑菌曲線產生差異，在乳液粒徑為150 nm時抑菌效果達到最好。王婧等[12]發現采用吐溫80所制備的氯代肉桂醛納米乳，平均粒徑為15.88 nm，抑菌活性提高了50%～200%。

圖5 肉桂精油乳液對大腸桿菌的抑制效果Fig.5 Inhibitory effect of cinnamon oil emulsion on Escherichia coli

2.6 肉桂精油乳液對金黃色葡萄球菌的抑制作用

肉桂精油乳液對金黃色葡萄球菌的抑制效果見圖6所示。空白組中金黃色葡萄球菌經過約15 h的調整期后，開始迅速增長，生長狀態良好。而乳液組在整個培養時間內（0～22 h），吸光度幾乎維持不變，且在5 h后，吸光度明顯低于空白組。表明金黃色葡萄球菌在肉桂精油乳液的作用下完全無法生長。對比乳液組發現，T-1.5%的抑制作用最強，T-0.5%和T-2.5%的抑制作用相差不大。要達到對金黃色葡萄球菌最好的抑菌效果，乳液的粒徑為150 nm。對比圖5和圖6可得，肉桂精油乳液對大腸桿菌的抑制效果要優于金黃色葡萄球菌。分析原因為金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，細胞壁厚；大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，細胞壁薄。細胞壁組成結構的不同引起了抑菌效果的差異[13]。肉桂精油可通過破壞微生物的細胞壁、細胞膜，損傷DNA而發揮抑菌作用[14-15]。

圖6 肉桂精油乳液對金黃色葡萄球菌的抑制情況Fig.6 Inhibition of Staphylococcus aureus by cinnamon oil emulsion

3 結語

作者首先通過改變肉桂精油的添加量（質量分數）0%～2.5%，利用司班20和吐溫80為復合乳化劑，制備出粒度范圍在50～280 nm的乳液。隨后探討了離心轉速、溫度、儲藏時間對肉桂精油乳液穩定性的影響。乳液經2 000～12 000 r/min離心處理，粒徑維持不變，穩定性較好。在高溫條件下（60、80℃），乳液粒徑顯著增大，且出現分層現象，而在溫度低于40℃時，穩定性較好。相比于4℃，乳液更適于在25℃條件下儲藏，儲藏10 d以內，乳液的粒徑維持不變。最后，通過比濁法探討乳液的粒徑與抑菌性質的相關性。結果發現，當乳液粒徑為150 nm時，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果最好。本研究中通過乳化法提高了肉桂精油的穩定性，并探討了乳液的抑菌性，可為后期在具體食品體系中的防腐殺菌應用奠定基礎。