郫縣豆瓣生香酵母的篩選及生長特性

范智義，李 恒*，2，張其圣，2，陳 功，2，李潔芝，鄧維琴，陳相杰

（1.四川省食品發酵工業研究設計院 泡菜與調味品研究所，四川 成都611130；2.四川東坡中國泡菜產業技術研究院，四川 眉山620000）

關鍵字：郫縣豆瓣；生香酵母；菌株篩選；酵母生長特性

郫縣豆瓣是我國西南地區一種特色發酵蠶豆醬，以其味辣香醇、紅棕油亮、瓣粒酥脆、黏稠絨實、醬香濃郁[1]的特點為人所知，在烹飪與食品工業中廣泛應用。郫縣豆瓣的制作可大致分為甜瓣子發酵、辣椒醅發酵和混合后熟3個部分[1]。在郫縣豆瓣的甜瓣子發酵和混合后熟中，制曲時所產生的酶、微生物的代謝以及各類化學反應共同作用，水解原料中大分子物質的同時生成各類呈色、呈味和呈香物質，對郫縣豆瓣產品質量有著重要的影響。因此，改進豆瓣醬發酵工藝、提高發酵質量對高品質郫縣豆瓣的生產具有重要意義。

酵母是傳統發酵調味品釀造中常見的一類生香微生物，酵母代謝過程中可產生醇[2]、酯[3]、酚[4]以及呋喃化合物[5]等多種揮發性風味成分，有助于發酵調味品風味的形成。在傳統發酵調味品生產領域，技術人員利用生香酵母強化發酵，可起到縮短發酵周期、提高質量穩定性、改善產品風味的效果。在現代醬油生產中，生香酵母的添加已成為標準釀制工藝的一部分[6]。

郫縣豆瓣作為一種富有特色的傳統調味品，其發酵過程中風味的形成也離不開酵母菌的代謝生香。目前，人們在郫縣豆瓣中發現了多種酵母[7]，對這些酵母的研究和應用逐漸受到了的關注。楊倩等[8]從郫縣豆瓣中篩選出了一株可耐受26%氯化鈉的魯氏接合酵母，其能產生苯乙醇等多種發酵醬特征性風味物質；劉超蘭等[9]在郫縣豆瓣后熟階段向物料中接種了乳酸菌（3×106CFU/g）和酵母菌（1×106CFU/g），明顯增加了產品中的揮發性酯類和多種氨基酸的含量，縮短了陳釀時間；楊松彰等[10]將多種乳酸菌和耐鹽酵母復配后用于郫縣豆瓣強化發酵，發現郫縣豆瓣揮發性風味物質含量明顯提高。盡管如此，對郫縣豆瓣中產香酵母的篩選仍缺乏整體系統的研究，郫縣豆瓣的生產大多仍依賴于粗放的自然接種。作者從傳統郫縣豆瓣中篩選出一株具有生香能力的酵母菌株，并研究了該酵母菌株在不同食鹽質量分數、pH和溫度下的生長特性，以期為郫縣豆瓣酵母菌菌種資源的挖掘與利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

郫縣豆瓣分別于2017年和2018年的7～9月采集自成都市郫都區某企業，該企業郫縣豆瓣采用傳統工藝，依賴自然接種進行發酵和后熟。樣品在水泥條池后熟發酵約1個月后收集，裝于無菌采樣袋，-4℃儲存備用。

4-甲基-2-戊醇（色譜純）：Sigma公司產品；甲醇（色譜純）：重慶川東化工公司產品；其余分析純試劑：購于成都科隆化學制公司。2.5 L AnaeroGen培養袋、密封培養罐：Thermo Scientific公司產品；Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒：上海生工公司產品；YM培養基、PDA培養基、麥芽浸粉、瓊脂粉：青島海博公司產品；酵母蛋白胨、酵母浸粉：安琪酵母公司產品。

1.2 儀器與設備

分光光度計：上海儀電公司產品；Eclipse E100光學顯微鏡：尼康儀器公司產品；GCMS-TQ8040氣質聯用儀：島津公司產品；Agilent J&W DB-WAX高分離度氣相色譜柱（30 m×0.320 mm×0.25μm）：安捷倫公司產品；固相微萃取手柄（帶有50/30μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取纖維）：Supelco公司產品。

1.3 郫縣豆瓣中酵母菌的分離與鑒定

稱取樣品25 g，無菌水10倍稀釋，采用以下方法分離樣品中的酵母菌：方法一，取1 mL樣品稀釋液于培養皿，傾注含質量分數16%氯化鈉的YM瓊脂培養基，混勻后凝固，30℃厭氧培養；方法二，取1 mL樣品稀釋液于培養皿，傾注PDA固體培養基，混勻后凝固，30℃好氧培養。

挑取培養皿上單菌落，相應液體培養基擴培后提取菌體基因組DNA，送至成都擎科生物科技公司擴增18S rDNA后測序。測序結果與公開數據庫進行BLAST同源性比對，確定酵母種屬。

1.4 酵母產醇能力分析

酵母菌產醇能力測定參考Zoecklein等[11]的方法，并做簡化。各酵母菌株以1×106個/mL接種于含質量分數16%氯化鈉的YM培養基中，30℃密封靜置培養6 d。取適當稀釋培養液1 mL與2 mL質量濃度為2 g/dL的重鉻酸鉀溶液、1 mL濃硫酸混勻，60℃密封反應30 min，610 nm測定吸光度。代入乙醇梯度稀釋液，制備標準曲線，計算培養液醇的相對含量，以相當于乙醇的體積分數（%）表示。

1.5 酵母產香能力分析

依照1.4節所述制備酵母培養液，搖勻取2 mL于15 mL固相微萃取瓶，滴加2μL 0.5μg/mL的4-甲基-2-戊醇溶液作為內標物，混勻后60℃預熱2 min，固相微萃取纖維60℃恒溫吸附50 min。

萃取完畢后，將固相微萃取纖維插入氣質聯用儀進樣孔，氣相色譜分析以氦氣為載氣，柱流量0.93 mL/min，不分流，進樣口溫度250℃。柱箱初始溫度50℃，程序開始后10℃/min升溫至85℃，保持1.5 min；5℃/min升溫至100℃，保持1 min；2.5℃/min升溫至175℃，保持1.5 min；10℃/min升溫至250℃，保持2 min。質譜離子源溫度230℃，質荷比（m/z）掃描范圍為35.0～350.0，電子轟擊能量70 eV，檢測器電壓0.1 kV。揮發性成分的鑒定利用NIST05譜庫檢索結果與人工圖譜解析共同確定。質量分數采用內標法進行定量分析。

1.6 培養基氯化鈉質量分數、pH和培養溫度對酵母生長的影響

分別配制氯化鈉質量分數為0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%的YM培養液，pH值為2、3、4、6、8、9、10的YM培養液（含質量分數5%氯化鈉），接入1×104個/mL酵母菌，30℃靜置培養。對培養溫度的研究中，將接入1×104個/mL酵母菌的YM培養液（含質量分數為5%的氯化鈉）置于4、10、20、30、37、40℃的條件下培養。

培養開始后，每隔一定時間取2 mL搖勻的培養液，620 nm測定吸光度。酵母生長進入穩定期后，搖勻培養液，使用血球計數板對酵母細胞進行計數。

1.7 數據分析

以上所有指標均進行3次獨立試驗，取平均值。采用Tukey法對組間數據差異的顯著性進行檢驗（P＜0.05），使用Origin 2018作圖。

2 結果與分析

2.1 郫縣豆瓣醬中酵母的分離與鑒定

經高鹽兼性厭氧和無鹽好氧2種分離方法，從郫縣豆瓣中共獲得28株酵母，10株（編號BP01～10）通過方法一獲得，18株（編號BP11～28）通過方法二獲得（表1）。所有酵母菌株中，17株為魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii），占所獲菌株的大部分，3株酵母菌屬于接合酵母屬（Zygosaccharomyces），但未鑒定到種，其余8株分屬奧默柯達酵母（Kodamaea ohmeri）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、 庫 德 里 阿 茲 威 氏 畢 赤 酵 母（Pichia kudriavzevii）和 伯 頓 絲 孢 畢 赤 酵 母（Hyphopichia burtonii）。魯氏接合酵母菌株多采用高鹽兼性厭氧培養分離得到，其余種類的酵母則是通過無鹽好氧方法分離得到的。

表1 郫縣豆瓣中分離獲得的酵母菌菌株編號、形態特征和種屬Table 1 Identification numbers,morphological characters and species of strains isolated from Pixian bean paste

續表1

魯氏接合酵母是郫縣豆瓣、黃豆醬及其他種類蠶豆醬發酵、后熟中最主要的酵母菌之一[7,12-13]。高鹽厭氧環境模擬了郫縣豆瓣發酵時醬醅內部的狀態，利用該方法分離得到的魯氏接合酵母菌株在郫縣豆瓣醬醅中可能也有較強活性，并在風味形成中發揮著作用。釀酒酵母是面包制作和釀酒中常見的酵母[14]，而庫德里阿茲威氏畢赤酵母、奧默柯達酵母和伯頓絲孢畢赤酵母在食品中較少被報道。利用無鹽好氧方法分離得到酵母菌種類相對豐富，但高鹽兼性厭氧分離方法卻并未獲得這些菌株，說明其在高滲、低氧的條件下生長受到了明顯的抑制，可能不是發酵過程中主要的酵母菌。

2.2 酵母產醇能力分析

30℃培養5 d后，接種各酵母菌株的培養液中的醇相對含量如圖1所示。魯氏接合酵母及接合酵母屬菌株培養液中的醇相對含量均在0.9%以上，而其他種屬酵母的產醇能力較弱，培養液醇相對含量均低于0.6%，這有可能是由于其耐鹽性差，在高鹽培養液中生長受抑導致的。所有試驗組中，接種菌株BP02、BP20、BP05、BP04、BP08、BP03、BP10和BP01的培養液醇相對含量均在1.06%以上，產醇能力較強，后續實驗選取這些菌株做進一步研究。

圖1 各酵母菌株培養液中的醇相對含量（以乙醇的體積分數計）Fig.1 Alcohol contents in culture broths of different yeast strains(expressed as ethanol volume fraction)

2.3 酵母菌產香能力分析

各酵母菌株于30℃培養5 d后，與空白組培養液相比，接種酵母菌株的培養液中揮發性風味物質質量分數顯著增加（見圖2），其主要揮發性物質包括醇、酯、酸、酮、酚、醛六大類。其中，醇類物質質量分數最高，各菌株培養液中的醇類物質質量分數均在17 ng/g以上，占揮發性物質的絕大部分，醇類物質以苯乙醇、乙醇和3-甲基丁醇為主（數據未展示）；酯類物質為第二大揮發性風味物質，其在各組中質量分數在0.23～2.99 ng/g之間，以菌株BP02和BP20培養液中質量分數最高，均在2.8 ng/g以上；酸、酮、酚、醛在各菌株培養液中的質量分數極少，均不超過0.7 ng/g。所有酵母菌株培養液中，BP02的醇、酯質量分數最高，產香能力較優。

圖2 培養5 d后各酵母菌株培養液中揮發性風味物質Fig.2 Contents of volatile compounds in culture broths of different yeast strains after 5 d incubation

根據各酵母菌株的產醇、產香能力，選取魯氏接合酵母菌株BP02進行后續研究。BP02菌落呈現白色圓形，菌落表面干燥，易于挑起（見圖3（a））。挑取菌落鏡檢，可觀察到球形或橢球形細胞，并存在明顯的出芽現象（見圖3（b））。

圖3 魯氏接合酵母BP02的菌落和細胞形態Fig.3 Colonial and cellular morphology of Zygosaccharomyces rouxii BP02

2.4 氯化鈉質量分數對魯氏接合酵母BP02生長的影響

圖4為魯氏接合酵母BP02在不同氯化鈉質量分數的YM培養基中的生長曲線及穩定期細胞計數。隨著培養基氯化鈉質量分數的增加，BP02菌株延滯期時間先減后增，對數期生長速率及穩定期培養液吸光度則呈現先增后減的特點。培養基氯化鈉質量分數為5%時，BP02菌株的延滯期最短，對數期生長速率最大，穩定期培養液吸光度最高，生長最旺盛。氯化鈉質量分數高于25%時，BP02菌株培養期間吸光度始終在0.1以下。氯化鈉質量分數在0%～25%范圍內，BP02菌株穩定期細胞密度均在1×107個/mL以上，其中氯化鈉質量分數為5%的試驗組穩定期細胞密度最大，達2.78×108個/mL，但在氯化鈉質量分數為0%～25%的范圍內各組穩定期細胞密度差異不顯著。總體來看，BP02菌株具有較強的耐鹽性，可耐受最高含有質量分數20%氯化鈉的培養環境。

圖4 魯氏接合酵母BP02在含不同氯化鈉培養條件下的生長曲線及穩定期細胞計數Fig.4 Growth curves and cell counts of Zygosaccharomyces rouxii BP02 cultured in sodium chloridewith different concentrations

魯氏接合酵母是一種典型的耐鹽酵母菌，Jansen等[15]的研究表明魯氏接合酵母可在培養基氯化鈉質量分數為0%～18%范圍內均可旺盛生長。本研究中，培養液氯化鈉質量分數在0%～20%時，魯氏接合酵母BP02的生長速率雖有所不同，但穩定期細胞密度基本一致，培養液氯化鈉質量分數為25%和30%時，雖然在培養過程中培養液吸光度未發生明顯改變，但細胞計數結果顯示，與初始接種密度1×104個/mL相比，25%和30%氯化鈉組的細胞密度明顯增加，說明在極高質量分數氯化鈉的培養環境中，魯氏接合酵母BP02仍可緩慢生長。根據本實驗室之前的研究，郫縣豆瓣甜瓣子發酵階段的氯化鈉質量分數一般在14%，后熟階段豆瓣醬的氯化鈉質量分數則在18%左右，因此，魯氏接合酵母BP02可較好適應郫縣豆瓣發酵過程中的高鹽環境。

2.5 pH對魯氏接合酵母BP02生長的影響

圖5為魯氏接合酵母BP02在不同pH YM培養基中的生長曲線及穩定期細胞計數。可以看出，菌株BP02可在pH值為3～8的范圍內生長，在此范圍內，菌株BP02的延滯期呈現先減后增的趨勢；在pH值為4和6時，相對于其他試驗組，BP02菌株的延滯期最短，生長最迅速，穩定期細胞密度均在1×108個/mL以上，二者生長曲線幾乎完全重合，表現出相似的生長特性；pH值為3時，BP02菌株的延滯期增加，穩定期培養液吸光度和細胞密度也顯著下降，而培養基pH值為8時，BP02菌株的延滯期明顯延長，但穩定期培養液吸光度和細胞密度較pH值為4和6的試驗組沒有明顯差異。

圖5 不同pH下魯氏接合酵母BP02的生長曲線及穩定期細胞計數Fig.5 Growth curves and cell count of Zygosaccharomyces rouxii BP02 cultured in different pH

魯氏接合酵母可適應廣泛的pH培養環境，據Restaino等[16]報道，魯氏接合酵母在含有質量分數12%葡萄糖的培養基中可在pH值為1.5～10.5的環境下生長，其最適生長pH值為3.5～5.5；ONishi等[16]的研究則表明，無鹽條件下魯氏接合酵母可在pH值為3～7的條件下生長，而在含有質量分數18%氯化鈉的培養環境中其生長pH值為4～5。pH對魯氏接合酵母生長的影響可能與培養環境中的營養成分密切相關，但可以明確的是，在pH值為4～6的弱酸性環境中生長情況最好，這與Yong等[17]的研究結果相一致。郫縣豆瓣甜瓣子發酵過程中，醬醅的pH值由初始的6.0～6.5下降到發酵后期的4.0～4.5，并在后熟中維持穩定，整個發酵、后熟過程的pH環境均有利于魯氏接合酵母BP02的生長。

2.6 培養溫度對魯氏接合酵母BP02生長的影響

圖6為魯氏接合酵母BP02菌株在不同培養溫度下的生長曲線及穩定期細胞計數。可以看出，隨著培養溫度的上升，BP02菌株的延滯期逐漸縮短，但在10～30℃，各試驗組穩定期培養液吸光度和細胞密度無顯著差異，培養溫度為37℃時，魯氏接合酵母BP02對數期生長速率最快，但穩定期培養液吸光度和細胞計數較10～30℃各組顯著降低；培養溫度為30℃時，BP02菌株的生長最為旺盛，但培養溫度為4℃時，在整個培養過程中BP02菌株幾乎不生長。

圖6 不同溫度下魯氏接合酵母BP02的生長曲線及穩定期細胞計數Fig.6 Growth curves and cell counts of Zygosaccharomyces rouxii BP02 cultured in different temperatures

VAN uden等研究了溫度對酵母生長的影響后認為，當溫度高于一定值后，酵母菌的熱死亡會成為影響比增長速率的因素之一，同時存活的細胞對葡萄糖的消耗也會增加，導致穩定期酵母得率的減少。由此可以推測，隨著培養溫度的升高，魯氏接合酵母BP02的比增長速率提高，但當溫度達到37℃時，由于比死亡速率的增加小于比增長速率的增加，相對于30℃酵母菌的對數期生長速率仍有所提高，但酵母對葡萄糖消耗的增加，用于增殖的營養相對減少，37℃環境下BP02穩定期細胞計數及吸光度較30℃培養條件均有所降低，與本研究一致。Yong等[17]報道稱37℃魯氏接合酵母的生長速率較室溫（28℃）快，但穩定期細胞數量則低于室溫培養的魯氏接合酵母。實際生產中，短時間發酵（3個月內）的甜瓣子在發酵時會控制溫度在30～35℃，而長時間（1年以上）發酵的甜瓣子及后熟過程一般在常溫下進行。從魯氏接合酵母BP02的生長特性來看，在強化發酵時及后熟時將溫度控制在合理的范圍，可促進其快速增殖，有利于產品風味的形成。

3 結語

本研究中通過無鹽好氧和高鹽兼性厭氧2種方法，從傳統郫縣豆瓣中分離得到了28株酵母菌，主要為魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii），也分離得到了奧默柯達酵母（Kodamaea ohmeri）、庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和伯頓絲孢畢赤酵母（Hyphopichia burtonii）等。通過產醇試驗可知，魯氏接合酵母在高鹽培養條件下產醇能力較強，而其他酵母的耐鹽性較差，產醇能力弱。經過產醇與產香試驗，從分離獲得的酵母菌株中篩選出了風味生成能力較強的魯氏接合酵母BP02。經研究，該菌株最高可耐受質量分數20%的氯化鈉，在pH值為3～8、10～37℃均可生長。其在氯化鈉質量分數為5%、pH值為4～6、30℃的培養環境中生長最旺盛。總體來看，魯氏接合酵母是郫縣豆瓣中最主要的酵母菌，并具有一定的生香能力。本研究中篩選出的產香魯氏接合酵母BP02在高鹽、弱酸和中溫的培養條件下生長良好，該生長條件與郫縣豆瓣發酵體系相一致，說明菌株BP02高度適應郫縣豆瓣醬醅環境，可作為強化菌種用于提高郫縣豆瓣的風味品質。