益生乳酸菌與腸道菌群穩態

白曉曄，孫志宏，張和平*

（1．內蒙古農業大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，內蒙古 呼和浩特010018；2.內蒙古農業大學 農業農村部奶制品加工重點實驗室，內蒙古 呼和浩特010018）

腸道是個復雜的微生態系統，棲息著數以萬計的微生物種群，包含細菌、真菌、古生菌、原生動物和病毒，它們的穩定平衡對于維持宿主健康至關重要，腸道菌群紊亂會引起各種臨床疾病[1-2]，例如Ⅱ型糖尿?。╰ype 2 diabetes）[3]、肥胖（obesity）[4]、炎癥性腸炎（inflammatory bowel disease，IBD）[5]和慢性腹 瀉（chronic diarrhea）等疾病[6]。大量研究表明，益生菌或可通過靶向腸道菌群使其維持穩態，進而保證宿主健康[7-11]。

益生菌（probiotic）是指服用適當劑量對宿主產生有益作用的活的微生物[12-13]，被認為是安全、無毒副作用的[14]。乳酸菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）是一類發酵碳水化合物產生乳酸、無芽孢、不運動或很少運動、過氧化氫酶呈陰性的革蘭氏陽性細菌的總稱[15]。在乳酸菌范疇中，最常用、最主要的益生菌多數隸屬于乳酸桿菌，而Lactobacillus acidophilus，Lactoba-cillus casei，Lactobacillus rhamnosus和Lactobacillus helveticus是被廣泛研究的幾種乳酸桿菌[10]。益生乳酸菌不僅對腹瀉、炎癥性腸炎、乳糖吸收不良和早產兒壞死性小腸結腸炎等疾病具有臨床益生功效[5，16-17]，而且還有助于緩解高壓人群壓力、焦慮，提高其記憶和認知力[18]，改善季節性花粉過敏健康人群的生活質量[19]。

雖然益生乳酸菌具有良好的益生功效，但是其益生機制還未達成共識。通常認為益生菌可通過增加腸道中有益菌、降低腸道中致病菌來調節腸道菌群結構來緩解被擾亂的腸道菌群，進而維護宿主健康[7-11]。而Sanders等[20]研究發現益生菌可減少腸道菌群變化幅度或促進失調的腸道菌群快速恢復正常，推測益生菌的益生功效是通過保護宿主腸道菌群免受破壞進而維持腸道菌群平衡，他們認為益生菌的主要作用是能夠調控宿主腸道菌群處于穩定狀態，不強調對腸道中特定菌群的影響[21-22]。益生乳酸菌如何調節和維持腸道菌群穩態還有待深入研究。作者闡述了益生乳酸菌對宿主腸道菌群穩態的影響，及其維持腸道菌群穩態的可能機制。同時指出了維持腸道菌群穩態的重要性及目前計算腸道菌群穩態的方法，并提出了目前益生乳酸菌研究中存在的不足及未來的研究方向。

1 腸道菌群穩態及其評估

腸道菌群是個非常復雜的微生態，其中的微生物種類繁雜、數量龐大。在不考慮研究對象的地理來源、體重指數、年齡或性別時，糞便的微生物群落聚集成了3種類型，即根據糞便中菌群結構將腸道分為3種腸型；如果考慮飲食、地理來源、健康狀態、疾病類型等因素，腸道菌群似乎又是一個無序的微生態[23]。而且，目前對健康腸道菌群組成及結構的認知還有待進一步完善。雖然許多研究追蹤了使用益生乳酸菌對腸道菌群的影響，試圖計算或衡量益生乳酸菌對腸道菌群穩態的改變（見表1），但是“腸道菌群穩態”這一定義至今還無科學一致的定義。如何判斷某一微生態是否失衡仍是一個挑戰。

早在2007年，Jussi Vaahtovuo等為了簡單明了地描述復雜的微生物群變化，開發了計算腸道中微生物平衡的指數（Microbial Balance Index，MBI），并在仔豬飼養試驗中，觀察到MBI與仔豬體質量日增長 量（daily weight gains，DWG）呈 正 相 關[24]。2017年，MK AlShawaqfeh等[25]發現，患有慢性炎性腸病的犬與健康犬相比，其腸道中存在一些差異性細菌，比如Faecalibacterium、Turicibacter、Escherichia coli和Streptococcus等，于是他們利用qPCR對這些差異菌群進行定量，使用不同數學算法構建了評估菌群改變的失衡指數（dysbiosis index，DI）。這種基于qPCR的失衡指數是基于最近原型（質心）分類器構建，并且在單個數值中顯示失調的程度，該數值測量了受試樣品與每個類別的“標準模型”的接近程度。換言之，就是受試樣本與健康樣本之間的歐幾里得距離（Euclidean distance）和受試樣本與疾病樣本之間的歐幾里得距離之間的差別。DI值為0意味著受試樣本與健康樣本和疾病樣本的中心距離相等，DI值為負數時表示微生態正常，而DI值為正數時，表示微生態失調，且DI值越大表示失衡越嚴重。計算結果顯示，患有慢性炎性腸病的犬的平均DI值為3.3，而健康犬的為-4.8，患有慢性炎性腸病的犬的DI值顯著高于健康犬。

目前用于腸道菌群穩態評估較受認可的算法是2014年Gevers等[26]提出的微生物失衡指數（Microbial Dysbiosis index，MDI）。他們在推斷回腸微生物群組成的相關網絡時，發現同一疾病中的一些菌群是同時存在且同時增加或減少，而不同疾病中變化趨勢是不同的。于是基于這一現象提出了MDI，即所有樣品中豐度增加的細菌的總相對含量除以所有樣品中豐度降低的細菌總相對含量，然后取對數得到的一個值，即微生物失衡指數。該MDI值源于疾病表型，與臨床疾病嚴重程度呈顯著正相關，與物種豐富度呈負相關。Sahil Khanna等[27]在研究糞菌移植對艱難梭狀芽孢桿菌感染患者腸道菌群影響時，為了描述群落組成的變化，也使用了Gevers等提出的MDI，其中，MDI評估由18個分類群完成，包含了與IBD嚴重程度正相關和負相關的細菌群。結果發現艱難梭狀芽孢桿菌感染患者腸道微生物失衡指數顯著高于供體的。Kelly A.Shaw等[28]在分析IBD患者腸道菌群變化時，也引入了MDI，指出IBD患者腸道中微生物失衡指數顯著高于健康對照組的。此外，在研究過程中，生態失調指數降低，與治療和隨后的臨床改善一致；生態失調指數與PCDAI測量的臨床嚴重程度顯示出強烈的相關性。表明MDI可捕獲IBD患者中微生物組的改變及其與疾病活動的臨床和生化測量相關性。MDI除了用于評估腸道菌群是否失衡，2017年Rui M Ferreira等[29]還使用MDI對胃炎和胃癌患者胃黏膜菌群進行了分析計算，發現胃癌患者胃中MDI值較胃炎患者的高，且MDI與香農指數呈負相關，即胃癌患者胃中微生物較胃炎的失衡程度高。同時還發現，MDI可用于區分胃炎和胃癌，與使用單一分類群相比，MDI在檢測胃癌方面表現出更高的靈敏度和特異性。

表1 腸道菌群穩態評估指數Table 1 Homeostasis index of gut microbiota

2 益生乳酸菌對腸道菌群穩態的影響

隨著人類對基因認知的加深，腸道菌群這一“器官”逐漸受到重視。Sanders通過總結分析關于益生菌對腸道菌群影響的報道發現，腸道菌群失衡與許多疾病相關[30]。通常認為失衡的腸道菌群具有均一度和豐富度下降，有益菌降低、有害菌增加等特征[31-32]，而益生乳酸菌可通過增加腸道中有益菌的數量，改變細菌結構，降低致病菌及其毒素，加強腸黏膜屏障功能和細胞因子調節來緩解被抗生素或疾病擾亂的腸道菌群，進而維護宿主健康[7-11]。例如，肥胖患者腸道菌群多樣性及Bacteroidetes/Firmicutes數量比值下降，丁酸鹽產生菌和抗炎菌等有益菌豐度降低，而條件致病菌急劇增殖[33-37]。而復合益生菌Lactobacillus acidophilus、Bifidobacterium longum和Enterococcus faecalis可明顯地重塑高脂肪和高蔗糖飲食大鼠腸道中細菌比例，增加與肥胖呈負相關細菌的豐度[33]。Park等[38]研究益生菌Lactobacillus curvatus HY7601和Lactobacillus plantarum KY1032對高脂誘導的肥胖大鼠腸道菌群影響時發現，與食用安慰劑的高脂飲食大鼠相比，益生菌組大鼠的腸道中Bifidobacterium pseudolongum的相對豐度比安慰劑組高約10倍，但是益生乳酸菌干預并不影響大鼠腸道優勢菌門，Firmicutes和Bacteroidetes仍然是大鼠腸道中優勢菌門。類似的，益生乳酸菌還可調節Ⅱ型糖尿病[39]、膽固醇高[40]、潰瘍性腸炎[41]、腸易激綜合征[42]、炎性腸病[43-44]和哮喘[45]、非酒精性脂肪肝[46]等疾病患者的腸道菌群結構，增加其腸道菌群中有益菌，改善其菌群功能多樣性。此外，一些研究還報道了益生菌對健康人群腸道菌群的影響。比如，Matsumoto等[47]采用隨機、雙盲、安慰劑對照方法評估益生菌對健康志愿者糞便微生物群影響時發現，與未服用Lactobacillus casei Shirota發酵乳的志愿者相比，服用益生菌發酵乳后的志愿者腸道中總細菌數、共生雙歧桿菌和短鏈脂肪酸（乙酸，丙酸和丁酸）顯著增加。Ferrario等[48]指出，服用Lactobacillus paracasei DG補充劑增加了健康志愿者腸道中Blautia/Coprococcus數量的比率，且志愿者糞便菌群的整體結構顯著改變。Kwok等[49]對攝入L.plantarum P-8的33名健康志愿者（老年組、中年組、青年組）腸道菌群進行分析發現，Lactobacillus plantarum P-8增加了腸道內有益菌的數量，降低致病菌的數量，使腸道菌群健康化，尤其對老年人腸道菌群的改善效果最為顯著。

然而，有報道發現服用Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum或Lactobacillus rhamnosus雖然緩解了海馬腸炎癥狀，但是其腸道菌群結構幾乎沒有變化，推測這些益生乳酸桿菌可能是通過促進腸道菌群穩態，抑制了弧菌搗亂[21]。Kajander等[22]研究服用混合乳酸菌菌株的腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）患者腸道菌群，發現其腸道中的細菌特定變化較小，也推測益生菌補充可能促進微生物群的穩定化。Kristensen等[50]系統分析了2015年8月之前關于益生菌對健康志愿者腸道菌群改變的報道后指出，服用益生菌對健康志愿者腸道菌群豐富度、均一性或α多樣性無影響，并未顯著改變其腸道菌群結構與組成。這可能是因為健康人群腸道菌群處于穩定平衡狀態，益生菌對其腸道菌群結構及特征的作用較小。此外，Wang等[51]指出腸道微生態是個復雜多變的生態，腸道中改變的微生物并不一定與疾病改善相關。因此，評估益生乳酸菌益生功能不能僅局限于考慮其特定細菌組成變化，還要考慮整個腸道菌群穩態。

同時，研究益生乳酸菌對腸道菌群穩態還需要考慮菌株差異性。早期Yoo等[52]使用Lactobacillus plantarum KY1032和Lactobacillus curvatus HY7601兩株菌在單獨給藥時，發現這2種菌株改善脂質代謝和全身性炎癥的能力不同，但是未分別評估每株菌對腸道菌群的影響。此后Wang等[51]比較了Lactobacillus paracasei CNCM I-4270、Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690和Bifidobacterium animalis ssp.lactis CNCM-I2494三株單獨的益生菌菌株對高脂誘導的代謝綜合征小鼠生理和腸道微生物群落結構的影響。發現這3株菌均減緩了小鼠體重增加、葡萄糖耐受不良和肝臟脂肪變性，恢復了高脂飲食誘導的腸道菌群的改變，但是每株菌對宿主炎癥和腸道菌群影響程度不同，它們會選擇性地改變與代謝綜合征發展顯著相關的關鍵細菌物種子集。

3 益生乳酸菌調節腸道菌群穩態機制

具有益生功能的乳酸菌可通過以下幾種方式調節宿主腸道菌群平衡：1）與腸道中病原菌競爭結合位點或分泌物質抑制病原菌；2）分泌代謝物為腸道中有益共生菌提供適宜生長繁殖的環境；3）刺激宿主免疫系統應答調節腸道菌群平衡，見圖1。

圖1 益生乳酸菌調節腸道菌群穩態機制Fig.1 The regulatory mechanism of lactic acid bacteria with probiotic function for the intestinal flora homeostasis

3.1 益生乳酸菌抑制腸道中病原菌維持腸道菌群穩態

維持腸道菌群穩態不僅需要腸道中共生微生物自身的穩定，還需要平衡外來入侵的致病菌。大量研究指出，食用具有益生作用的乳酸菌顯著降低了宿主腸道中的食源性致病菌及其感染的嚴重程度，保護宿主的作用[53-59]。但是益生菌拮抗致病菌的活性作用，與傳統的抗生素改變腸道中復雜微生物群落組成不同，益生菌僅對宿主腸道中微生物進行抑制和調控。此外，益生乳酸菌還可與腸道中病原菌競爭結合位點對其進行抑制。Johnson-Henry等[60]發現Lactobacillus rhamnosus GG能抑制致病性大腸桿菌O157∶H7對HT-29腸上皮細胞的黏附[60]，Mukai等指出益生乳酸菌還可通過增加腸道中雙歧桿菌的豐富度競爭空腸黏膜上的沙門氏菌的定植位點[61]。此外，某些乳酸桿菌與幾種腸道病原體共享碳水化合物結合特異性，這使得它們能夠與那些病原體競爭宿主細胞受體位點[62-63]。它們還可以表達與Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）等跨膜宿主模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）結合的微生物相關分子模式（MAMP），從而通過競爭排除病原體[64]。此外，乳酸桿菌益生菌株還具有特異性吸附特性，能通過表面蛋白和黏附素之間的反應抑制致病菌的定植[65]。除了如上所述的競爭排斥之外，益生乳酸菌還可通過分泌蛋白質降解碳水化合物受體、建立受體類似物的生物膜和產生生物表面活性劑來抑制病原體黏附[66]。益生乳酸菌與致病菌競爭的程度還取決于菌株及它們的分布和黏附素對各自細菌表面的特異性受體和親和力決定[67]。

3.2 益生乳酸菌產生代謝產物調節腸道菌群穩態

在維持腸道菌群穩態過程中，益生乳酸菌產生的代謝產物也發揮了重要作用。Tejero Sarinena等[68]發現，乳酸菌可通過產生乙酸、丙酸、丁酸和乳酸等短鏈脂肪酸抑制如Salmonella enterica，Serovar typhimurium和Clostridium difficile等致病菌。腸道中產丁酸鹽的細菌還可以將乳酸菌產生的乳酸轉化為丁酸，這種短鏈脂肪酸（SCFA）在腸細胞中具有多種益處，對于腸內穩態至關重要[69]。此外，短鏈脂肪酸能夠維持結腸中的pH值，使其維持在合適的范圍，這對于腸道中眾多細菌酶的表達以及腸道中外來化合物和致癌物質的代謝至關重要[70]。益生乳酸菌還可通過分泌如乳酸、醋酸和抗菌物質等物質抑制腸道中的致病菌[71]，改變它們生存的環境，使其競爭對手處于不利環境[72]。Macfarlane等[73]還發現益生乳酸菌可以在整個腸道中使用底物，或者提供可以原位分解底物的酶，從而影響共生細菌生長的所需底物。

3.3 益生乳酸菌刺激免疫系統維持腸道菌群平衡

腸道微生物群與宿主免疫系統之間的相互作用始于出生時，微生物群影響免疫系統的發育，免疫系統反過來塑造微生物群的組成[74]。益生乳酸菌除了直接影響宿主腸道中細菌菌群外，還刺激宿主抗病原體防御途徑，例如刺激或激活防御素生成中涉及的途徑，而防御素是小腸隱窩細胞和腸上皮細胞中的Paneth細胞等細胞產生的陽離子抗菌肽[75]，這種抗菌肽可以抑制腸道中致病菌。益生乳酸菌的抗原成分（例如細胞壁化合物）能夠通過腸道上皮和Peyer氏斑塊表面上的M細胞穿過腸道。當抗原分子穿過腸道時，它們可以刺激靈活的固有免疫系統，進而調節腸道菌群平衡[76-77]。類似的，益生乳酸菌還能刺激抗菌免疫活性減少腸道中某些微生物的數量，下調腸道炎癥，促進有益于腸道生理的微生物[30]，加強腸上皮細胞緊密連接，降低細菌移位的發生[78]。益生乳酸菌還通過刺激上皮細胞的完整性來對抗腸道致病微生物的定植和增加黏膜的完整性[79]。

4 腸道菌群穩態的重要性

人類與腸道菌群共同進化了數百萬年，隨著抗生素大量使用、飲食過度精細而缺乏細菌可利用碳水化合物、過度注重衛生和剖腹生產等生活方式的改變，以及環境溫度和晝夜規律變化，環境改變，人類腸道菌群發生了巨大改變[80-82]，破壞了人類與腸道菌群之間原有的共生平衡關系，伴隨而來的是一系列如炎癥性腸病，腸易激綜合征、癌癥、哮喘和糖尿病等慢性非傳染性疾病的發生，這也暗示了腸道微生態改變可能是引了這些疾病的原因[80]。從代謝的角度來看，腸道菌群被認為是能夠調節宿主生理和免疫的聯合體[83]。Lin等[84]也指出腸道菌群失衡會引起免疫紊亂，進而引起代謝綜合征（如肥胖、糖尿病胰島素抗性等）、中樞神經系統紊亂（情感、認知障礙）和心血管疾病 （動脈粥樣硬化）。此外，Larmonier等[85]在研究腸道菌群與骨骼健康時發現，腸道菌群失衡對宿主骨骼健康也有影響。腸道微生物還可通過模式識別受體（PRRs）影響局部和全身炎癥[86-87]。因此，維持腸道菌群穩態是保證宿主健康的有力保障。

5 展望

益生菌應用日益廣泛，不僅在醫藥和食品領域研究成果顯著，在化妝品和生物高科技等領域也越來越受到重視。中國市場調研在線發布的中國益生菌市場現狀調研與發展前景分析報告（2017-2023年）認為：“目前世界上益生菌產業每年的增長速度為15%～20%”，益生菌產業將是一個非常龐大的產業。目前研究和應用的益生菌大部分是乳酸菌，因此益生菌產業即益生乳酸菌產業。雖然益生乳酸菌應用前景廣闊，但是關于其研究還有很多問題亟待解決。首先，并不是所有乳酸菌都能作為益生菌使用，能稱得上益生菌的乳酸菌不僅要對宿主具有益生作用，耐酸耐膽鹽，還要能在宿主應用位置或腸道中定植、存活并生長，且能夠在適宜儲存條件下維持其活性[88]，因此益生菌篩選和使用必須嚴格按照這些標準執行。其次，目前研究中益生乳酸菌使用量為1×108～1×1011CFU/（g·次），連續使用時間為2～16周，使用量和食用時間各不相同，益生乳酸菌的持續使用時間和使用量目前尚無定論，還有待商榷。此外，目前研究使用的益生乳酸菌菌株各不相同，健康的腸道菌群也不止一種模式，所以不存在一株適用于世界各國各民族人群、不同疾病的益生菌。亟須通過大量采集不同國家各個地區人群糞便，完善和構建腸道菌群大數據庫，包括健康人群腸道菌群數據庫、各種疾病特征腸道菌群數據庫、不同民族和地域人群特有菌群數據庫及全人類菌群數據庫，以當地居民腸道菌群數據為基礎，結合當地居民腸道菌群構成特點，篩選出符合當地居民的個性化益生菌。