利用均勻設計法優化二孢擬奧德蘑母種培養基*

蘇楚亮，袁征超，楊昱儀，薛玲娜，盧 意，劉紫荊，劉 然，莫美華

（華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

二孢擬奧德蘑（Hymenopellis raphanipes）隸屬于擔子菌門（Basidiomycota）傘菌目（Agaricales）膨瑚菌科（Physalacriceae）[1]。郝艷佳等[2]提出一個新的分類中Hymenopellis屬為多系類群，其與Protoxerula、粘蘑Mucidula、刺孢Dactylosporina和Ponticulomyces等屬均應歸并到小奧德蘑屬（Oudemansiella）中。目前對二孢擬奧德蘑相關研究較少，國內有其粗多糖的提取及應用等相關研究的報道[3]；國際上對二孢擬奧德蘑的研究還停留在物種鑒定水平，分子及生理活性研究較少，其他學術領域未見報道。通過在前期對二孢擬奧德蘑母種培養基采用單因素優化的基礎上，進一步明確培養基中的碳源、氮源、氨基酸、維生素、無機鹽等成分含量；通過均勻設計試驗研究各成分之間的相互作用，從而獲得最佳的母種培養基配方，在為二孢擬奧德蘑的深入研究提供優質菌種的同時，也為二孢擬奧德蘑實現工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

二孢擬奧德蘑（H.raphanipes）（GDMCC No：60886）菌種，原始菌株由莫美華教授及其研究生采自廣西省桂林市貓兒山國家自然保護區（N25°52′56.22″，E110°29′32.53″；海拔 1 500 m），由華南農業大學食品學院應用真菌試驗室分離、鑒定、保存并提供。

1.2 培養基制備

1.2.1 PDA培養基制備

選取馬鈴薯200 g，洗凈去皮切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，紗布過濾，加15 g葡萄糖和20 g瓊脂，充分溶解后于121℃滅菌20 min，取出冷卻后貯存備用。

1.2.2 可溶性碳酸鈣清液配制

稱取10 g可溶性輕質碳酸鈣，溶于1 L水中，攪拌溶解靜置10 min后取上層清液，添加相應量到試驗組中。

1.2.3 氨基酸配制

氨基酸的用量極小，在添加氨基酸的過程中，對于難溶性氨基酸，可用熱水溶解稀釋到所需濃度，再添加到培養基中[4]。

1.2.4 維生素配制

維生素用量不多，當其以溶液形式存在時，大多數結構不穩定，易受到光和熱破壞[5]。因此，應在弱光環境下過濾除菌后現配現用，避免高熱和紫外線等外界環境影響，盡量保留其有效活性。

1.3 菌種活化

取出5只二孢擬奧德蘑試管種，分別置于10℃、17℃、24℃的生化培養箱培養1 d，恢復菌種活性[6-7]。后轉接至PDA平板培養基，進行菌種活化。從活化菌種中挑選出無污染、菌絲形態健壯、潔白度好的優質菌種平板，采用滅菌打孔器將菌種均勻打成0.5 cm的圓片，供后續試驗接種使用[8]。

1.4 均勻設計試驗

1.4.1 均勻設計試驗方案的制定

根據單因素篩選碳源、氮源、氨基酸、維生素、無機鹽的結果，選取淀粉、麥芽浸膏、酵母膏、VB1、天冬氨酸、脯氨酸、硫酸銨、碳酸鈣清液、磷酸二氫鉀、硫酸鎂10個因素作為均勻設計的參試因子，每因子設12個水平，見表1，采用10因素12水平的均勻設計表U12（1210）進行試驗設計，見表2，試驗方案見表3。按照表3的試驗方案配制母種培養基，于121℃滅菌20 min，冷卻備用。

表1 參試因素水平表Tab.1 Levels table of test factors

表2 U12（1210）均勻設計表Tab.2Uniform design table of U12（1210）

表3 二孢擬奧德蘑母種培養基優化試驗方案Tab.3 Optimization scheme of stock medium of Hymenopellis raphanipes

1.4.2 各組分的添加方式

淀粉、麥芽浸膏、酵母膏、脯氨酸、硫酸銨、碳酸鈣清液、磷酸二氫鉀、硫酸鎂直接添加到培養基中進行高壓蒸汽滅菌；VB1、天冬氨酸、脯氨酸3種熱敏性的組分通過濾徑為0.22 μm無菌脂溶性過濾器過濾添加到培養基中[9]。

1.4.3 接種培養

每組試驗方案設置3個重復。將優質菌種平板圓片接種于正中間區域，后倒置于26℃恒溫生化培養箱避光培養。

1.5 數據統計與分析方法

所有試驗均設計3個重復，采用DPS v9.5數據處理軟件進行數據分析和處理。采用Duncan新復極差法進行方差分析。對均勻設計的試驗結果使用二次多項式回歸分析方法，通過數學模型模擬獲得最優配方[10]。

2 結果與分析

2.1 均勻設計試驗優化結果

均勻設計試驗結果及試驗過程中統計的指標潔白度、菌絲密度[11]結果見表4、圖1。

表4 二孢奧德蘑母種培養基優化均勻設計試驗結果Tab.4 Optimum and uniform design test results for the culture medium of Hymenopellis raphanipes

由表4、圖1可知，試驗組8的菌絲生長速度最快，試驗試劑對菌絲的促生長作用效果明顯，同時菌絲潔白度和菌絲密度2個指標的相對值為“最濃密”和“較潔白”，該組試驗為直觀最優；而試驗組12菌絲潔白度和菌絲密度的菌絲生長特征明顯，菌絲生長速度也較快，為了進一步驗證該試驗結果，可以選擇試驗組8和試驗組12作為后續驗證試驗的試驗組。

以表4中數據菌絲生長速度為目標函數（Y），用DPS v9.5對數據進行二次多項式逐步回歸分析，所得回歸方程為：

對回歸方程進行檢驗，得到復相關系數R=0.999 999，由此可見，菌絲生長速度與回歸方程中試驗因素的含量有緊密的相關性，其顯著性檢驗值F值=49 999.925 0，顯著水平P值=0.003 5＜0.01，剩余標準差SSE=0.000 1，調整相關系數Ra=0.999 989，回歸方程極顯著，說明方程的可信度較高。方程中各項試驗因子的回歸系數和t檢驗結果見表5。

表5 各回歸項的回歸系數檢驗Tab.5 Regression coefficient test of each regression item

由表5可知，方程中有X1（淀粉）與X8（碳酸鈣清液）、X2（麥芽浸膏）與X8（碳酸鈣清液）、X2（麥芽浸膏）與X9（磷酸二氫鉀）、X3（酵母膏）與X5（天冬氨酸）、X3（酵母膏）與X6（脯氨酸）、X4（硫酸銨）與X10（硫酸鎂）、X6（脯氨酸）與 X10（硫酸鎂）共7組的交互作用及X2（麥芽浸膏）、X4（硫酸銨）2因素的平方項P值均顯著水平小于0.01，說明他們對菌絲生長速度影響很大，達到極顯著水平。樣本的觀察值、擬合值和擬合誤差見表6。

由表6數據顯示，觀察值與擬合值接近，最大擬合誤差絕對值僅為0，進一步說明了回歸方程的準確性。

2.2 均勻設計試驗結果的驗證

通過DPS v9.50進行回歸分析，并通過數學模型模擬得到二孢擬奧德蘑母種培養基的理論最優組合試驗方案見表7，將其與組間最優配方8、配方12和真菌通用培養基PDA進行對比培養驗證試驗，結果見表8、圖2。

表6 配方的觀察值、擬合值和擬合誤差Tab.6 Observed value,fitted value and fitted error of the samples

表7 二孢擬奧德蘑優化培養基配方驗證試驗方案Tab.7 The validation test scheme of the optimum stock medium of Hymenopellis raphanipes

表8 二孢擬奧德蘑優化培養基配方驗證試驗結果Tab.8 Results of validation test of the optimum stock medium of Hymenopellis raphanipes

由表8、圖2可知，在理論最優配方的培養基中，二孢擬奧德蘑菌絲生長速度最快，菌絲密度和潔白度最高；其次為組間最優配方8和配方12，而PDA培養基生長速度最慢，且理論最優與配方8、PDA培養的二孢擬奧德蘑菌絲生長速度存在顯著差異，而配方8與配方12、配方12與PDA培養菌絲生長速度無顯著差異。因此，二孢擬奧德蘑菌絲生長最適母種培養基為理論最優配方，每升培養基中含淀粉27.50 g、酵母膏5.50 g、硫酸銨1.10 g、天冬氨酸0.02 g，脯氨酸 220.00 μg、VB11.44 μg、可溶性碳酸鈣清液11.00 g、磷酸二氫鉀10.97 g。

2.3 培養基中硫酸銨（X4）與二孢擬奧德蘑生長速度的關系

通過DPS v9.50對10個參試因子進行單因素變量與生長關系的分析可知，當培養基中添加一定濃度的硫酸銨時，促進菌絲的生長，取其作為單因素試驗設計，培養基中硫酸銨濃度（X4）與二孢擬奧德蘑生長速度相關性見圖3。

從圖3中可以看出，二孢擬奧德蘑的生長與硫酸銨有較強的相關性，硫酸銨濃度在一定范圍內，隨著添加量的增加能明顯促進菌絲生長，表現為較強的正相關關系。在菌絲利用培養基成分的過程中，硫酸銨主要提供游離的NH4+，有利于菌絲直接吸收和轉化氮源，進而提高菌絲的生長速度和生物轉化率[12]。因此在二孢擬奧德蘑菌絲培育的過程中，可合理添加適量的硫酸銨，有利于培育出優質的菌種。

3 結論

近年來，國內對小奧德蘑屬的部分菌株已實現了人工馴化栽培[13]，二孢擬奧德蘑菌株屬于新發現的小奧德蘑屬真菌，目前對其相關研究較少，通過在前期對母種培養基單因素優化的基礎上，進行均勻試驗設計優化，從而確定二孢擬奧德蘑最佳的母種培養基配方，為二孢擬奧德蘑的深入研究提供理論依據。據文獻報道，小奧德蘑屬的大多數種如厚褶小奧德蘑（O.crassifolia）、鱗柄小奧德蘑（O.furfuracea） 等[14-16]可食用，粘小奧德（O.raphanipes）[18]等種甚至可能會成為重要的藥用菌種；目前已有的資料表明[3]，二孢擬奧德蘑富含粗多糖，其相關成分具有一定的藥理價值。

均勻試驗設計的試驗結果表明，試驗組8和試驗組12的二孢擬奧德蘑菌絲生長最佳，菌絲潔白度、菌絲密度指標優良，同時結合DPS v9.50顯著性分析，理論最優的的試驗配方生長效果顯著，遠遠大于試驗組8和試驗組12；再結合驗證性試驗結果，可以明顯看出理論最優組配方為最佳配方。因此確定二孢擬奧德蘑母種培養基最佳配方為：每升培養基中含淀粉27.50 g、酵母膏5.50 g、硫酸銨1.10 g，天冬氨酸 0.017 g，脯氨酸 220.00 μg、VB11.44 μg，可溶性碳酸鈣清液11.00 g、磷酸二氫鉀10.97 g。此外，在二孢擬奧德蘑母種培養基優化的試驗因子中，硫酸銨的適量添加能夠明顯促進菌絲生長，有利于培育優質的二孢擬奧德蘑母種。

與目前大多可商業化栽培的奧德蘑屬的母種培養基相比，試驗所得的母種培養基配方具有成分明確、碳氮比合適、無機鹽成分合理、生長因子添加量適宜等優點[19-20]，避免了母種培育過程中培養基成分的盲目添加，有利于生物轉化率的提升和菌絲形態特征等指標的優化，避免菌種傳代過程菌種退化現象并促進其優良性狀的表達[21]，從而為二孢擬奧德蘑優良菌種的培育提供保障，有利于提高二孢擬奧德蘑出菇時的生物轉化率，進而培育出優質的二孢擬奧德蘑子實體，為其商業化栽培提供理論依據。